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| 奧林巴斯微分干涉顯微鏡調試方法 |
| 發布時間:2021-04-23 14:56:17 | 瀏覽次數： |
奧林巴斯微分干涉顯微鏡調試方法 只要儀器能夠接受偏振濾光片和專門設計的聚光鏡和物鏡棱鏡（以及外殼），微分干涉對比（DIC）光學元件可以安裝在任何明場透射，反射或倒置的顯微鏡上，技術。 
所有主要的顯微鏡制造商都為他們的研究級顯微鏡生產DIC附件，這些附件經常被捆綁在一起，作為包含所有所需硬件和光學元件的匹配套件。在標準配置中，微分干涉對比顯微鏡（見圖1）包含通常在偏振光顯微鏡上遇到的偏振元件，此外還有兩個特殊構造的雙折射復合棱鏡。Termed Wollaston或Nomarski棱鏡，這些光學分束器（和光束組合器）定位成將剪切波前的干涉圖案投影到聚光鏡前焦平面和物鏡后焦平面。 圖1中顯示了傳輸差分干涉對比顯微鏡的典型光學列車配置。從燈絲中的局部鄰域發出的半相干波前通過位于顯微鏡基座中的光端口和冷凝器組件之間的線性偏振器。復合Nomarski或Wollaston棱鏡位于聚光器孔徑（前焦平面）內或其附近，用于將入射偏振波前對準并剪切成兩個正交分量。垂直剪切波前由聚光透鏡系統聚焦成平行束，平行束橫穿樣本平面，并根據樣本的光程長度參數通過變形對折射率和厚度梯度作出響應。 物鏡聚集的光波匯聚在第二個Nomarski棱鏡所在的后焦平面上。目標Nomarski棱鏡將剪切和變形的波前重新組合成線性和橢圓偏振光，隨后使分量通過位于物鏡上方的中間管中的分析器（垂直于分極偏振器定向的第二偏振器）。*后，從分析儀出射的線性偏振光分量在目鏡光闌（或相機投影透鏡）的圖像平面通過相長干涉和相消干涉重新組合。 DIC顯微鏡的偏振元件 在DIC顯微鏡中使用的偏振器與用于偏振光觀察的偏振器類似或相同，但是許多制造商提供匹配的DIC偏振濾光器，其具有低和高光傳輸效率。在放大倍數范圍（40x，60x和100x）的上端，DIC優先使用具有高透射效率的偏振器，因為樣品細節更清晰，并且較大的偏置延遲值可用于視頻和數字成像。低透射偏振濾光片對于使用10倍和20倍物鏡的DIC觀察是有用的，但是在較高放大倍數下嚴重限制光透射。 
在大多數顯微鏡上，偏振器直接安裝在儀器底座的光源端口或安裝在冷凝器下方的濾光片支架上。設計用于跨越光端口的偏光鏡通常安裝在旋轉組件中，使顯微鏡工作人員能夠將濾光鏡旋轉90度至180度角（見圖2（a））。一旦旋轉偏振器定位在所需的傳輸方位，它可以用鎖定螺釘固定到位。按照慣例，起偏器的取向是振動傳播軸位于東西方向（當站在顯微鏡前時從左到右）。將偏振器連接到底座聚光器安裝支架的顯微鏡配備有可以或不可以使偏振器旋轉的外殼（圖2（b）和2（c））。具有圓形幾何形狀的偏光鏡可裝入舞臺上的支架中，并可通過一個緩沖裝置以固定增量45度旋轉。其他偏振片安裝在矩形框架內，可滑入冷凝器支架中的一個槽中（圖2（b）和2（c）），并且通常包含可在180至360度范圍內旋轉的指輪。 分析儀放置在目標Nomarski棱鏡和配備DIC觀察的顯微鏡中的目鏡觀察管之間，類似于這些組件在偏光顯微鏡中的位置。該分析儀也是一個線性偏振器，它的傳輸方位與偏振器的方向成90度角。按照慣例，分析儀的振動方向為北 - 南，與偏振器規定的東西方位重合。 分析儀的顯微鏡安裝配置與偏光鏡的安裝配置相同，并且這些部件通常插入到光學系統中的許多位置。在某些顯微鏡中，分析儀被固定在一個矩形框架中（圖2（e）），并插入鼻鏡，中間管或垂直照明器的槽中。其他分析儀設計具有相同的框架樣式，但是可以使用通常以10,45或90度增量分度的指輪旋轉分析器元件（圖2（f））。配備DIC觀察的偏光顯微鏡常常將分析儀放置在位于物鏡鼻鏡和觀察管之間的中間管中（見圖2（d））。這些裝置通常設計用于偏振光下的精密測量，并具有環繞圓周的360度刻度游標刻度，并具有鎖定機制，可將分析儀固定在所需的傳輸方位角上。此外，分析儀通常安裝在滑塊上，因此可以方便地從光路中移除以進行線性偏振或明場觀測。偏光顯微鏡的中間管也包含20×6毫米DIN標準插槽用于四分之一波長，全波或德塞納蒙補償器（圖2（d）和圖5）。 
現代顯微鏡將偏光鏡和分析儀定位在與現場鏡頭，冷凝器，物鏡和觀察管相關的重要位置。在較老的顯微鏡中，這些偏振元件可以安裝在各種各樣的位置。然而，應該注意的是，將偏振元件放置在共軛圖像平面內（或非常接近共軛圖像平面（視場光闌，樣品臺或目鏡固定光圈））并不是一個好主意，因為玻璃上的劃痕，缺陷，污垢和碎片表面可以與樣品一起成像。 聚光鏡和目標棱鏡 如圖3所示，DIC聚光棱鏡通常安裝在一個旋轉式轉臺冷凝器中，該冷凝器用作分束器以產生對入射偏振光波前的角度剪切，該冷卻器設計用于容納至少三個單獨的棱鏡。轉塔規格和配置根據制造商，但他們通常包含四到八個輔助組件的插槽，包括Wollaston或Nomarski棱鏡，相位對比圓環或暗場光圈。圖3所示的冷凝器轉臺包含七個開口，其中三個充滿相位對比環，三個充滿DIC棱鏡。開槽用于明場觀察。 每個聚光器DIC棱鏡（也稱為補償器或輔助棱鏡）必須與窄范圍的客觀數值孔徑專門匹配，因此特定棱鏡可能只適用于一個或兩個物鏡（例如，10x和20x）。因此，必須使用三到五個聚光棱鏡來匹配10x和100x之間的整個物鏡放大范圍。一些制造商根據特定目標調整每個聚光棱鏡，因此需要多達7個聚光棱鏡來跨越具有不同數值孔徑的干燥和油浸物鏡的整個范圍。 冷凝器DIC棱鏡插件采用陽極氧化圓形鋁板制成，具有組合棱鏡（通常為圓形），用光學膠粘劑固定在精確的方向上。DIC棱鏡楔塊非常薄且切割緊密，以確保角度剪切值與客觀數值孔徑所需的匹配。拋光板必須小心處理，以避免指紋，油污，灰塵和碎屑污染。每個棱鏡框包含一個槽或銷，與冷凝器轉臺中的相應配合器配合，以便確定和確保冷凝器棱鏡相對于物鏡棱鏡和偏振器（和分析器）軸的對準。 
物鏡和分析儀之間放置的是第二個Nomarski復合棱鏡，用于重新組合由聚光棱鏡剪切的波前（圖1,4和5）。這個棱鏡通常被稱為目標或主體DIC棱鏡可以與特定的聚光棱鏡匹配，或者單個物鏡棱鏡可以用來重新組合具有由所有聚光棱鏡表示的剪切角譜的波陣面。大多數顯微鏡制造商配置他們的DIC顯微鏡采用一個單一的目標Nomarski棱鏡，它安裝在一個矩形框架，滑入鼻甲（見圖4）。為了將偏差延遲引入DIC光學系統，目標棱鏡騎在滑動支架上，滑動支架可借助于千分尺控制旋鈕在顯微鏡光軸上來回移動。 目的DIC棱鏡設計用于通過整個顯微鏡光軸上的平移來引入偏置延遲，并制成長軸與棱鏡剪切方向相對應的矩形（圖4（b））。在正確對準的DIC顯微鏡中，聚光棱鏡通過聚光鏡和物鏡系統的組合作用成像到物鏡棱鏡上。結果，由聚光棱鏡產生的波前剪切在沿著兩個棱鏡的表面的每個點（它們彼此相反）精確匹配。沿著剪切軸轉換任一棱鏡會產生波前失配（偏移延遲），這反過來會引起在整個顯微鏡光圈內均勻的光程差。 圖4中示出了來自不同制造商的幾種客觀棱鏡滑塊設計。所有復合棱鏡都被安放在矩形框架中，并且平移控制旋鈕位于框架的末端。采用控制旋鈕將棱鏡位置沿剪切軸橫向移動（圖4（b）），以便將偏差延遲（或凈波前光程差）引入微分干涉對比度光學系統。設計用于反射光DIC顯微鏡的Nomarski棱鏡滑塊還包含第二個控制旋鈕（圖4（c）和4（d）），可在整個物鏡放大倍率和數值孔徑范圍內調整棱鏡高度以匹配不同的后焦平面位置。當顯微鏡在另一個成像模式下操作時， 
在用DSénarmont補償器設計引入偏差延遲的DIC顯微鏡中，客觀Nomarski棱鏡通過固定安裝座固定在物鏡上方的鼻托上（圖5（c））。使用deSénarmont補償器的顯微鏡對于每個物鏡都需要一個單獨的物鏡棱鏡，但通常可以將相同的聚光器Nomarski棱鏡用于兩個或更多個物鏡。通過將框架從顯微鏡鼻梁上滑開，可以輕松地從光路中移除固定的物鏡棱鏡安裝座（圖5（c））。 圖5（a）示出了用于deSénarmont微分干涉對比的典型偏振器和四分之一波長延遲板配置。該單元安裝在顯微鏡基座上的視場光闌調節旋鈕上，并在對準延遲板光軸和偏振器傳輸方位角后，用鎖定固定螺絲將其固定到旋鈕上。偏光鏡軸標記在deSénarmont補償器單元的前部，刻度線可以使操作員定性確定偏光鏡旋轉時引入系統的偏差延遲量。鎖定旋鈕可用于相對于四分之一波長板保持偏光器不動。對于明場觀察或沒有DIC的增強對比技術， 用于deSénarmontDIC補償的另一種技術是將四分之一波長補償板放置在目標Nomarski棱鏡和分析儀之間的光學系統中。在這種情況下，或者在聚光棱鏡下采用標準線性偏振器，或者圖5（a）中所示的deSénarmont補償器設置為偏振器軸平行于延遲板快軸（僅線性偏振光從補償器出射）并垂直于分析儀。圖5（b）顯示了一個用于在物鏡棱鏡后引入deSénarmontDIC補償的中間管。在這種情況下，通過旋轉分析儀而不是偏振器來將偏差延遲引入光學系統。 圖5（b）中所示的中間管配備了用于觀察物鏡后焦面的Bertrand透鏡，也有一個DIN標準插槽，能夠容納各種延遲板，包括deSénarmont補償器（如圖所示）。分析儀可以通過精密分度游標機制旋轉，使操作員能夠定量確定引入DIC光學系統的偏差遲滯水平。使用deSénarmont補償器，可以以0.15納米的精度輕松測量介于二十分之一至全波長范圍內的偏置延遲值。另外，伯特蘭透鏡可以通過拇指輪方便地插入光路中，以便觀察物鏡后焦平面發生的事件。 
在DIC顯微鏡中，對比度是樣本取向的函數，遇到的各種幾何形狀通常需要重新定位樣本以*大化對比效果以觀察目標結構。使用標準的矩形機械平臺來觀察DIC樣本受到這些組件表現出的有限范圍的旋轉運動的阻礙，盡管x - y翻譯機制減輕了仔細檢查顯微鏡載片全部內容的負擔。為了使樣品容易旋轉和操縱以呈現*佳的方位對比度，建議對DIC顯微鏡使用類似于圖6（a）所示的圓形旋轉臺。圓形臺使樣品旋轉360度，這對于在DIC中顯示極端方位對比效應的延伸線性樣品（例如硅藻或絲狀結構）通常是必需的。觀察期間標本的平移通過使用直接附著在圓形平臺上的漸變機械舞臺附件（圖6（b））并牢固夾住顯微鏡載玻片。舞臺應該沿顯微鏡光軸居中， 設計用于微分干涉對比度的物鏡必須沒有應力或雙折射遮擋，使光線去極化并導致圖像退化。過去，顯微鏡專家僅限于用于偏振光觀察的無應變消色差和螢石物鏡，但是具有較高校正因子的現代物鏡現在可用于DIC顯微鏡。全面通用目標，這些*的鏡頭系統通常可用于組合DIC，熒光，相襯和明場顯微鏡，而無需改變目標。此外，新設計的復消色差物鏡具有足夠的無應變，可用于偏振光和差分干涉對比觀察，在較高放大倍數下顯著改善圖像質量和分辨率。 微分干涉對比顯微鏡對準 在嘗試配置顯微鏡進行差分干涉對比觀察之前，請檢查儀器以確定是否存在所有必要的組件，并且沒有絨毛，灰塵和碎屑。包含應力信號的物鏡和聚光鏡元件可能會降低DIC中的圖像，臟透鏡表面，劃痕和污染光路中的異物也會降級。正確對準顯微鏡對獲得*佳結果和生成顯示偽三維和陰影效果的圖像至關重要。以下步驟中列出的許多步驟只有在首次對準DIC顯微鏡時才需要，并且不需要重復進行日常觀察。每次使用顯微鏡進行DIC檢查時應采取其他步驟。 初步的顯微鏡檢查 - 仔細檢查顯微鏡以確保安裝了所有必需的DIC組件，或者在需要時提供并準備好使用。拆下冷凝器，拆卸轉臺，并檢查Nomarski或Wollaston棱鏡的狀況。這些復合棱鏡的表面應該清潔，沒有灰塵和碎屑。由于它們安裝在冷凝器轉盤內，DIC聚光棱鏡幾乎不會被指紋污染，但灰塵和棉絨很容易流入轉盤并落在其中一個平坦的石英表面上。要清潔受污染的棱鏡表面，請使用橡膠氣球除去松散的纖維和灰塵，和/或用鏡頭紙或濕軟棉輕輕擦拭表面。小心不要劃傷表面。應該對客觀棱鏡給予同樣的治療，聚光鏡和物鏡外部透鏡元件，顯微鏡目鏡透鏡以及顯微鏡基座（或連接到倒置顯微鏡柱）的視場光闌端口處的場鏡。確保關鍵部件清潔后，重新組裝顯微鏡，安裝偏光鏡和分析儀，然后對光學系統進行科勒照明。 安裝偏光器和分析儀 - 拆下顯微鏡（冷凝器，DIC棱鏡和至少一個物鏡），將偏振器和分析儀分別安裝在冷凝器下方和物鏡上方的位置。以類似于偏振光顯微鏡的方式，偏振器和分析器被定位成使得它們的透射方位彼此以90度角（垂直）相交。安裝在光源和聚光器之間的偏振器通常沿東西方向定向，或者在面對顯微鏡時從左向右定向。在某些情況下，偏振片和分析儀的位置都是由它們在安裝框架中的固定位置預先確定的，并且這些組件只能以單個方向插入顯微鏡光路中。通常情況下，偏振器支架上的標記指示傳輸方向，但是一些顯微鏡配備有角度漸變的旋轉偏振器支架（圖2）。分析器也可以用分級旋鈕旋轉，和/或可以包含指示傳輸軸的標記。 
當偏振器和分析儀交叉時（透射軸以90度角取向），當通過目鏡觀察時，視場顯得非常暗。這種情況被稱為*大滅絕。如果大量光線通過顯微鏡，并且視場不是黑色（或幾乎黑色），請檢查以確保偏振器和分析儀交叉。穿過偏光鏡后，插入聚光鏡和物鏡，但不要安裝物鏡Nomarski棱鏡滑塊（或固定支架）。將聚光鏡轉盤旋轉至明場位置（缺少相位板或DIC棱鏡的插槽）。視場應保持黑暗，但如果這些組件（聚光鏡或物鏡）中的任何一個包含應變透鏡元件，則可能會有一些光線通過。在進入下一步之前，從光學組件（偏振器或分析儀）上取下一個偏振元件。 建立科勒照明 - 在進行DIC配置之前（安裝偏振片后），應使用標準K?hler技術將顯微鏡光學系統對準明場標本觀察。在正確配置后，光源的圖像（通常是鎢鹵燈）應通過安放在燈箱內的收集器透鏡或沿顯微鏡框架基座內的光學系統投射到聚光器孔徑光闌平面上。同時，聚光透鏡系統還將視場光闌的圖像投影到樣本共軛平面（在顯微鏡階段）。在燈絲居中之后（大多數現代燈箱包含一個預先居中的燈），0或B位置）。使用10倍物鏡將光闌調焦，疊加在聚焦標本上，然后打開虹膜葉片，直到在視場外圍邊緣只有一小部分光闌可見。對每個使用的物鏡采取類似的步驟，通過調整場和孔徑光闌，確保顯微鏡正確配置科勒照明的每個物鏡。在DIC日常觀察過程中，應定期檢查顯微鏡以確保科勒照明得以維持。 檢查物鏡后孔 - 配置科勒照明顯微鏡后，插入偏光鏡和分析儀，用相位望遠鏡或Bertrand透鏡（錐光觀察模式）檢查物鏡后焦平面。如果偏光鏡和分析儀正確定位并且顯微鏡完全對準，則物鏡光圈中將出現一個消光十字，如圖7（a）所示。消光十字的臂應垂直和水平取向，光圈四個角上出現少量光線（圖7（a））。影響消光十字的完整性的交叉或高度雙折射區域中的亮點是應變光學的一個指標。此外，位于共軛孔徑焦平面（聚光鏡或物鏡）附近的灰塵和絨毛顆粒在物鏡后孔處觀看時會顯得很亮。如果存在雙折射光斑，請檢查另一個無應變物鏡，以確定第一物鏡或聚光透鏡系統是否拉緊。在進行下一步之前，清除物鏡表面或聚光鏡表面上的污染灰塵，并更換應變光學元件（如果可能的話）。 目標DIC棱鏡對準 - 通過插入滑塊（圖4）或限定在固定底座上的棱鏡（用于使用deSénarmont偏置延遲的系統;參見圖5）來安裝目標棱鏡。一旦棱鏡就位后，再次用相位望遠鏡或伯特蘭透鏡檢查物鏡后焦平面。視場現在應該顯得非常亮，但沒有特征，單個黑色干涉條紋沿著剪切軸以45度角（參見圖7（b））延伸穿過孔徑直徑。根據顯微鏡是直立的還是倒置的，干涉條紋將以東北 - 西南（直立）或西北 - 東南（逆）方向穿過物鏡后孔。在任何一種情況下，干涉條紋都應該有明確的規定，如圖7（b）所示，并且位于孔徑的中心。 在某些DIC顯微鏡設計中，客觀棱鏡是固定的（deSénarmont補償），而在另一些DIC顯微鏡設計中，棱鏡可以通過滑塊框架中的定位螺絲機構在光軸上來回轉換。在后一種情況下，在通過望遠鏡或伯特蘭鏡頭觀察物鏡后焦平面的同時緩慢旋轉調節旋鈕。當旋鈕旋轉時，干涉條紋應遠離其中心位置移動至明亮后孔的上半部分或下半部分。或者，在deSénarmont補償器中轉動偏光器也會產生相同的效果。 
聚光鏡DIC棱鏡對準 - 從光學組件中取出目標棱鏡，并通過旋轉聚光鏡轉臺將*低光圈聚光棱鏡（用于10倍物鏡）擺動到位。適當的位置通常由轉臺上的紅色或白色10設置（或類似的代碼，例如L）標記）。重新聚焦相位望遠鏡或伯特蘭透鏡，觀察物鏡后焦平面出現的干涉條紋。再次，一個單一的邊緣應該存在與棱鏡產生的邊緣相同的方向（東北 - 西南方為直立顯微鏡，或者西北 - 東南方向為倒置顯微鏡）。聚光鏡和物鏡棱鏡的干涉條紋應該幾乎相同，并且應該沿著剪切軸具有相同的方向。 為了清晰觀察使用專為油浸設計的高數值孔徑聚光器的聚光棱鏡干涉條紋，可能需要使用擺動鏡頭控制桿移除前置鏡頭組件。如果物鏡孔中出現的條紋未正確定位，可能需要調整聚光鏡棱鏡的方向或對齊。在大多數情況下，聚光鏡棱鏡安裝在帶有缺口或銷釘（或鎖定螺釘）的保護性圓形鋁框架（圖3）中，以確保冷凝器轉盤內的正確定位。偶爾會有一個聚光棱鏡被迫進入轉臺而沒有正確對準，這在檢查干涉條紋時會很明顯。如果聚光棱鏡看起來不對齊， 標本觀察 - 將顯微鏡對準科勒照明，偏光鏡和分析儀交叉，并安裝兩個棱鏡（物鏡和聚光鏡），在鏡臺上放置一塊薄的透明懸掛標本（如頰粘膜上皮細胞制備物）。調整顯微鏡以獲得*大消光，并在通過正視模式下的目鏡（無伯特蘭透鏡或相位望遠鏡）觀察過程時聚焦試樣。在視場中觀察到的圖像應該顯得非常暗灰色，幾乎是黑色，在*大消光處，在具有明確定義的厚度或折射率梯度的區域（例如細胞膜和細胞核;參見圖8（b））中具有明亮高光。具有高折射率的球形樣品（例如浸沒油滴）甚至可以用作微小的鏡片， 在觀察聚焦的樣本圖像時，使用滑塊旋鈕轉換目標DIC棱鏡或在裝備deSénarmont補償裝置的顯微鏡中旋轉偏振器（或分析儀）。這種行為被稱為引入偏差延遲，并且將沿著剪切軸平移樣本的干涉條紋，并且對樣本外觀產生相應的變化。向一個方向移動棱鏡（正偏置）將減輕一個邊緣處的標本特征，同時使相反邊緣上的相同特征變暗并同時減輕背景（參見圖8（a））。一般來說，試樣呈假三維外觀，陰影效應與剪切軸方向相同。將棱鏡移動到顯微鏡光軸的另一側（負偏壓）會使光亮和黑暗的樣品區域反轉（比較圖8（a）和圖8（c））。 在所有DIC組件正確安裝并對齊的情況下，在*大消光度下，物鏡后光圈呈現深灰色（幾乎為黑色），并且在用相位望遠鏡或Bertrand透鏡觀察時，其相對均勻（圖7（c））。在大多數情況下，后孔的中心區域呈黑色，而周邊四個象限出現一些光線。消光十字通常看起來應該與單獨使用正交偏光鏡觀察到的十分相似，但通常會更暗，并且覆蓋物鏡后孔的較大區域。圍繞周邊的明亮區域（圖7（c））是由于聚光器和物鏡中偏振器和透鏡元件表面處的光部分消偏振而產生的偽像。 
通過掩蔽物鏡后孔徑中消光十字周邊的明亮區域，可以顯著改善微分干涉對比度圖像。這可以通過減小聚光器孔徑光闌的尺寸來消除亮邊。一般情況下，客觀的后孔尺寸應該減小到電容器光闌約全光闌的75％或80％。當光學系統完全對準時，消光十字直立出現（見圖7），并且可以觀察到由兩個寬干涉條紋組成，每個干涉條紋均以直角成形并且在物鏡后孔徑的中心會聚（條紋也可以在低質量顯微鏡中以正視模式可視化）。 在某些顯微鏡上，可以調整聚光鏡和物鏡棱鏡的位置以產生更均勻的條紋圖案，從而導致光圈的中心區域顯得更暗且更均勻。完成此任務是為了松開和旋轉（或升高或降低）聚光棱鏡，或者通過將偏振器和分析儀不交叉幾度。偶爾顯微鏡包含固定螺絲，可以調整聚光鏡和物鏡棱鏡，但如此配備的機型正變得罕見。作為顯微鏡對準的*后檢查，調整聚光鏡聚焦旋鈕，同時檢查物鏡后光圈的消光圖案，以確定是否可以改善。 通過平移物鏡棱鏡或以deSénarmont配置旋轉偏振器來調整偏差延遲，可顯著改善圖像外觀（*過在*大消光時觀察到的圖像外觀）并增加對比度。該操作對于微分干涉對比中的樣品成像是必不可少的，并且代表了顯微鏡光學組件調節的*后一步。在許多情況下，當觀察DIC圖像時，整個視場出現梯度光。除了在樣品的相對邊緣存在明暗強度以外，還會出現這種情況，這是由于光學系統產生的寬而不明顯的場邊緣偽影。具有良好匹配光學元件的顯微鏡使場條紋的尺寸*大化，它可以變得如此廣泛和均勻分布，整個領域呈現出統一的中灰色。然而，在大多數情況下，邊緣的一些證據仍然存在，并且視場呈現出從一個外圍邊緣到另一個邊緣的光強度的淺梯度（中等至較淺或較深的灰度）。這種偽影是特定光學配置中固有的，在觀察和采集DIC樣本圖像時應該忽略。 DIC顯微鏡中的補償器 通過在DIC顯微鏡的光學路徑中引入延遲板（或補償器），也可以增加樣品對比度。通常，在目標棱鏡和分析儀之間的中間管中插入一個全波（也稱為一階補償器）板，盡管該板也可以位于偏振器之后但在聚光棱鏡之前。這些板在綠色區域（通常接近550納米）處呈現整個波長的指定值的延遲水平，并且導致樣品顯示沿折射率和厚度梯度的黃色和藍色牛頓干涉色。由于從白光中減去綠色波長，背景呈現洋紅色。 在deSénarmont或標準（可轉換）Nomarski棱鏡DIC顯微鏡配置中，當客觀棱鏡的消光干涉條紋位于光路中心時，會出現類似于圖7（b）所示的圖案物鏡后焦平面（假設聚光棱鏡從光路上移除）。如果在物鏡棱鏡和分析儀之間放置一個全波延遲板，則圖9（a）所示的顯示牛頓干涉色光譜的干涉圖出現在物鏡后焦平面上。從光路上取下物鏡棱鏡并插入一個聚光棱鏡產生圖9（c）所示的圖案。 
翻譯目標Nomarski棱鏡或旋轉偏振片在deSénarmont補償器配置中將改變圖9（b）所示的牛頓干涉圖樣顏色。引入負偏差會將牛頓顏色轉換為減色值（黃色），而將棱鏡轉換為正偏差值會導致顏色相加（藍色）。由樣品梯度產生的顏色可以與Michel-Levy參考圖相比較以確定光程差的大小。 DIC顯微鏡配置錯誤 當微分干涉顯微鏡正確配置后，所得圖像通過似乎源自高度傾斜角度的陰影效果（見圖10（a））顯示偽三維性的真實性。但是，即使輕微的對齊誤差也會導致細微的標本細節惡化，并且配置中的嚴重錯誤可能會導致造成圖像無用的對比度急劇下降。DIC顯微鏡配置中*常見的錯誤是由于沒有交叉的偏振器，目標和聚光鏡棱鏡之間的不匹配，缺少聚光器DIC棱鏡或不正確設置聚光鏡光圈孔徑。其他問題可能會出現，特別是如果冷凝器和/或物鏡不是無應變的， 先前在顯微鏡對準部分中討論了確保偏振器交叉并且以正確的方向定位。有時候，偏光鏡或分析儀可能會因拇指輪刷或不小心使用儀器而意外旋轉離開位置。因此，總體樣本對比度降低，但許多功能常常保持可見。這種類型的錯誤可以通過使用固定偏振器和分析器或通過確保鎖定旋鈕設置為暫停偏振器旋轉來消除。大多數安裝在旋轉底座上的偏振片包含指示傳輸方位位置的標記。在開始DIC觀察之前，仔細檢查偏振器和分析儀的方向，以避免這些組件發生錯誤。 客觀和聚光棱鏡之間的意外不匹配是微分干涉對比顯微鏡中另一個常見的誤差來源。由于不同棱鏡之間的剪切角差異不一致，所得到的圖像顯示出極差的對比度（見圖10（c）），無法通過平移目標棱鏡或在德塞納蒙補償顯微鏡中旋轉偏振片來校正。冷凝器轉塔通常標有代碼，用于識別放置在光路中的棱鏡，檢查外部代碼順序以確保冷凝器棱鏡位于正確的槽內有助于避免這種類型的誤差。在物鏡筒上應該與使用中的聚光棱鏡的代碼相匹配。一般來說，當放大率改變時會發生棱鏡不匹配，但是不會旋轉聚光鏡轉盤以將匹配棱鏡插入光路中。有時候，冷凝器或冷凝器轉盤可能會丟失一個聚光鏡棱鏡，使其旋轉到包含棱鏡的位置（例如，明場位置;請參見圖3）。結果是與圖10（c）中所示的圖像類似的圖像，其缺乏對比度并且不顯示利用微分干涉對比度可獲得的高分辨率。 通常采用聚光鏡虹膜光圈來調整景深和對目鏡中觀察到的圖像或數字記錄和膠片記錄的對比度。在微分干涉對比顯微鏡中，寬光圈尺寸對于需要淺景深的光學切片實驗很有用，但高分辨率也是必要的。通常，通過使用較小孔徑所提供的*大對比度之間的折衷通過消除位于遠離焦平面的干涉標本特征來抵消。如果聚光器孔徑未充分打開（大約為物鏡孔徑的四分之三到四分之五），衍射偽影會遮蔽重要的樣品細節并嚴重降低圖像外觀（圖10（b））。一般來說， 當使用浸入水中的厚標本時，或者玻璃顯微鏡載玻片，培養皿或蓋玻片太厚時，由于球差可能會發生額外的誤差。這些錯誤表現為圖像沒有清晰聚焦，缺乏DIC圖像特征的陰影浮雕。通常可以調整高放大率干物鏡上的校正環以校正球差，但過厚的樣品必須用更薄的部分替換。當檢查培養細胞時，不要使用DIC光學系統和由注塑聚合物制成的培養容器。這些材料顯示應力雙折射并會產生混亂的圖像。相反，使用專門為DIC顯微鏡設計的玻璃容器，可以從幾家制造商那里購買。一般來說， DIC顯微鏡的照明源 在較低的放大倍數下（10倍至40倍），50瓦石英鹵素燈可提供足夠的光線，以便在DIC中進行令人滿意的觀察和記錄圖像。但是，在*高放大倍數（60x和100x）下，建議至少使用100瓦鎢鹵素光源。光源所需的照明強度取決于偏振器和分析儀的透射百分比，許多老式的DIC顯微鏡配備有透射率低（20％或更低）的偏振元件。然而，后來的模型顯微鏡通常配備高透射率偏振片（大于30％），這使得更高的光通量密度能夠通過光學系統，為*高放大倍數下的觀察和成像提供足夠的光線。 雖然粗糙的結構細節，如細胞邊緣和較大的細胞內成分（細胞核）可以用高強度鹵化鎢燈很容易地觀察到，但為了觀察*好的結構細節，具有窄帶寬的非常強烈的照明是必不可少的。汞弧放電燈在546納米（綠色）的可見光譜中心部分具有高能量峰值，可以通過以546納米為中心的窄帶寬（10納米）干涉濾光片進一步細化。另外，可以使用光擾碼器來增強窄帶寬照度以實現盡可能高的分辨率。請注意，無論光源如何，物鏡光圈應完全照亮，以獲得*佳效果。 結論 無論目標放大率和分辨率如何，差分干涉對比度顯微鏡中光學元件的正確位置和方向對于*佳性能至關重要。即使單個組件調整不當也會導致嚴重的圖像質量下降，影響儀器的陰影效果和分辨率。DIC顯微鏡中的兩個復合棱鏡和它們相關的偏振器是鏡像對。通過初始偏光鏡和聚光棱鏡的光波成像到物鏡棱鏡和分析儀上以產生*終圖像。為了使DIC正常工作，所有這四個組件必須處于正確的方向。對比度是通過改變物鏡棱鏡的橫向位置產生的，或者通過旋轉deSénarmont補償工具中的偏光片來實現。以這種方式，波前之間的光程差增大或減小以在樣本中產生對比度。 應該指出的是，DIC中的對比度是樣本光程長度的梯度的函數，當顯微鏡被適當地調整時，它們呈現偽三維浮雕。因為對比度是由折射率波動和/或厚度變化的組合引起的，所以使用該技術觀察到的表觀梯度可以對應于樣本形貌的實際變化，或者可以是例如局部蛋白質濃度梯度的函數。只有與樣本相關的結構特性的獨立知識才能幫助確定DIC顯微鏡中對比效應的絕對性質。 另外，即使確定陰影效應可以真正歸因于樣本中的高度變化，DIC中也沒有固有的機制來指出哪些特征代表了目標棱鏡的特定位置處的高原或低谷。該問題的定性解決方案是定位已知的樣品特征，例如玻璃上的劃痕，并觀察特征如何在目標棱鏡在光軸上平移時如何響應偏差延遲。具有相似響應的積分標本特征將是谷底或平臺，而具有相反響應的積分將具有相反的方向。 當用微分干涉對比檢查未知樣本時，顯微鏡專家應該警惕在邊緣產生的干涉色，這些色彩通常沒有特征，并且取決于方向，呈現非常淺或深的顏色。干涉色的存在表明樣品可能是雙折射的，因此不適合DIC觀察。這個事實可以通過在正交偏振照明下檢查樣品來證實，其中客觀和聚光DIC棱鏡都從光路中移除。 在微分干涉對比顯微鏡上施加的限制是執行該技術所需的昂貴的雙折射Nomarski或Wollaston棱鏡。這些成分比相差顯微鏡或霍夫曼調制對比顯微鏡所需要的要昂貴得多，這可以作為替代技術，特別是當觀察塑料容器中的活細胞時。另外，當使用相差來代替DIC時，非常薄或散布的樣本通常會產生更好的圖像，具有更多的對比度。較舊的復消色差物鏡可能不適用于DIC觀察，因為物鏡本身可能會顯著影響偏振光。在購買與DIC光學元件配合使用的高質量復消色差物鏡之前，顯微鏡專家應與制造商協商。
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