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霍夫曼調制對比系統旨在通過檢測光學梯度（或斜率）并將它們轉換為光強度的變化來增加未著色和生物材料的可見度和對比度。這項技術是由羅伯特霍夫曼博士于1975年發明的，并采用了多種適用于多種商業顯微鏡的配件。

Hoffman調制對比度的基本顯微鏡配置如圖1所示。被稱為Hoffman 的“ 調制器 ” 的光學幅度空間濾波器被插入到消色差或平場色片物鏡的后焦平面上（盡管也可以使用更高的校正） 。通過這個系統的光強度變化高于和低于平均值，根據定義，這個平均值據說是被調制的。用于調制對比度的目標可以覆蓋10倍到100倍的整個放大倍率范圍。該調制器有三個區域，如圖2所示：靠近后焦平面周圍的一個小的黑暗區域，它只透射1％的光線（圖2中標記為“ D ”的區域）;G “）;以及其余的透明或透明區域，覆蓋物鏡后部的大部分區域，其透射100％的光（標記為” B “的區域“在圖2中）與相位差顯微鏡中的相位板不同，霍夫曼調制器的設計不會改變通過任何區域的光的相位，當在調制對比度光學器件下觀察時，在普通明場中基本上不可見的透明物體顯微鏡具有由相位梯度決定的明顯的三維外觀，調制器不會引起通過調制器不同部分的光的相位關系的變化，而是影響主要的零階*大值，高階衍射極大值不受影響。使用邁克爾遜干涉儀確認通過霍夫曼型調制器的光的相位變化（如果有的話）以小于λ/ 20的因子變化。

在舞臺下面，帶有旋轉轉盤的聚光器被用來容納霍夫曼調制對比系統的其余部件。該轉塔式聚光器具有明場開口，帶有用于常規明場顯微鏡的孔徑光闌膜片以及為顯微鏡對準并建立科勒照明的適當條件。在每個其他轉塔開口處，都有一個偏心的狹縫，部分被一個小矩形偏光片覆蓋。狹縫/偏光鏡組合的尺寸對于不同放大率的每個目標是不同的; 因此需要轉塔布置。

Hoffman設計是這樣的，即狹縫位于聚光器的前焦平面上，如圖1和3所示。當光通過離軸狹縫時，它在物鏡的后焦平面成像（也稱為在傅立葉其中調制器已安裝平面）。包含離軸狹縫板的聚光器的前焦平面與物鏡后焦平面中的調制器光學共軛。圖像強度與樣本中光密度的一階導數成正比，并受相位梯度衍射圖的零階控制。

調制對比的原理提供了至少兩個圖2和圖3所示的基本調制器 - 狹縫板配置。為了本討論的目的，圖2所示的調制器板的圖示被放大并增加了尺寸。圖2和圖3（圖2（a）和圖3（a））左側的布置是對稱系統，其中調制器灰色條紋和狹縫都放置在顯微鏡的光軸（中心）上。此系統中的分辨率限于：

其中NA是物鏡的數值孔徑λ等于成像光源的波長平均值。黑色（1％透光率）和透光（100％透光率）區域的大小相同，而灰色（15％透光率）區域呈狹窄條紋形式，其為出瞳直徑的10％的目標。另一種布置（圖2（b）和3（b））是不對稱或偏移的，其中調制器的暗區位于物鏡的出射光瞳之外。這個系統的解決方案有了很大的改進和方法：

其中NA和λ的值與上述相同。很顯然，偏移系統中的分辨率（圖3（b））幾乎是中央系統（圖3（a））的兩倍。偏移系統中的透明（清晰）區域填充目標出瞳直徑的近90％，灰色和黑色區域填充另外10％。

在聚光鏡下面，在顯微鏡的出光口上放置一個圓形偏光鏡（注意兩個偏光鏡都在下面標本）。這個偏振器的旋轉可以控制狹縫開口的有效寬度。例如，如圖3所示，兩個偏振器彼此成90度的“交叉”導致狹縫“變窄”，使得其圖像落入調制器的灰色區域內。狹縫的部分由偏振器注冊在調制器的亮區。隨著偏光片旋轉，對比度可以變化以達到*佳效果。狹窄的狹縫產生的圖像非常高，與中等程度的連貫性相反。當狹縫調整到*窄位置時，光學部分成像也得到優化。當圓偏振片的振動方向與狹縫中偏振片的振動方向平行時，有效狹縫寬度*大。

調制對比系統的早期設計沒有利用顯微鏡光端口上的狹縫偏振器或圓偏振器，并且依靠如圖4所示的單一尺寸的狹縫進行對稱配置。在該圖中，來自光源的光通過固定光圈狹縫（在圖中稱為“狹縫板”），然后通過含有相位梯度的樣本。根據梯度的方向，這些梯度將光線偏轉到位于物鏡后焦平面內的對稱調制器的清晰或黑暗區域。得到的圖像顯示一個簡單的對比度梯度，這取決于樣品中相位梯度的位置和傾斜度。

在現代*的調制對比系統中，調制器和狹縫都偏離顯微鏡的光軸。這種安排允許更充分地使用物鏡的數值孔徑并產生良好的分辨率和細節。形狀和細節呈現陰影偽三維外觀。在灰色背景下，這些圖案在一側看起來較亮，中央部分灰色，另一側較暗。調制器將光學相位梯度細節（陡度，斜率，折射率變化率或樣本細節厚度）轉換為目鏡光闌平面圖像各個區域強度的變化。所產生的圖像具有明顯的三維外觀，并且對光學梯度具有定向靈敏度。

如圖5所示，相反的梯度導致狹縫圖像偏轉到調制器的非常暗的部分或調制器的亮部分。在該圖中，包含正和負相位（厚度）梯度的假想樣本和使用調制對比度光學元件成像平坦（非梯度）區域。圖5（a）中描繪的負梯度將光偏轉到調制器的黑暗區域，在那里它衰減到其前值的大約百分之一。同樣在圖5（c）中，通過正梯度偏轉到調制器的清晰區域的光未衰減，并且該光的100％被傳輸到中間圖像平面中。樣品的任何非梯度部分（圖5（b））以及調制器灰色部分的背景（環繞）寄存器，其中約15％的光被傳輸到中間像平面。結果是梯度一側的圖像區域的強度很暗。來自梯度反面的強度產生明亮的圖像區域，非梯度區域在圖像上呈灰色，背景也是如此。

黑暗和明亮區域與灰色的對比（與強度的變化有關）會產生陰影的偽浮雕效果。這是調制對比成像的典型特征。旋轉起偏器改變所獲得的對比度，并且臺上的樣本（相對于起偏器和偏移狹縫）的取向可以顯著改善或降低對比度。

由于調制器根據樣本的細節如何移動狹縫的圖像（從而導致改變光強度）來影響狹縫的圖像，所以它被描述為幅度濾波器。 霍夫曼和其他人已經證明樣本中的相位梯度，如空間頻率，分布在整個物鏡的出射瞳孔上。調制器的光透射強度分布將提供令人滿意的各種產生相位梯度的物體的圖像，包括：所有類型的細胞和組織（活體，染色和未染色）以及晶體，透明聚合物，玻璃的表面細節和其他類似的材料。反射光調制對比顯微鏡也可用于成像不透明和冶金標本中的晶界，以及復雜集成電路和其他電子材料的表面細節。

有許多優點以及對調制對比度的限制。其中一些優點包括更充分地使用物鏡的數值孔徑，從而產生出色的細節分辨率以及良好的標本對比度和可視性。盡管許多標準調制對比度目標是消色差或平面消色差，但如上所述，也可以使用對光學像差具有較高校正度的目標。許多主要的顯微鏡制造商現在在螢石校正等級中提供調制對比度目標，并且可以通過特殊訂單獲得解調透鏡。通?？梢允褂?/span>Modulation Optics，Inc.制造的調制器對舊的目標進行改進，該調制器由Robert Hoffman博士創建，專門用于構建售后和定制系統。

除了使用具有調制對比度的較高數值孔徑的優點之外，還可以進行“ 光學切片”景深被定義為從不同細節的成像出現的一級到下一級的距離，并且由物鏡的數值孔徑來控制。較高的數值孔徑物鏡顯示非常淺的景深，而對于較低數值孔徑的物鏡則相反。當樣品的光學均勻性降低時，隔離并專注于特定光學部分的目標的整體能力會降低。

圖像出現陰影或偽三維，由于細節兩側的對比差異而增強可見性。與使用相襯光學元件生成的圖像不同，圖像中不存在暈圈。調制對比度將相位梯度信息轉換為與由相差顯微鏡產生的相位關系變化（和光學路徑差異）非常不同的振幅差異。在調制器中使用黑色和灰色區域會生成包含不同灰度陰影的圖像，并且不含顏色。通過產生調制器可以將顏色引入到調制對比圖像中，其中灰色和黑色區域代替相同透射率值的彩色區域。在這種情況下，來自相位梯度的結果圖像以具有相同色調的相似梯度的顏色呈現。目前，我們不知道任何含有彩色區域的調制濾波器的商業來源。

消色差或平面反射鏡是調制對比顯微鏡*廣泛使用的目標，因為它們可以產生良好的圖像，因為不涉及顏色。將這些物鏡與綠色濾光片（放置在偏光片下方）配合使用可以進一步改善圖像，因為消色差物質在綠光下進行了球面校正。更高校正的目標，包括螢石和消色差片，也可用于調制對比顯微鏡，但增加的費用通常不值得提高圖像質量，除非放大率非常高。

調制對比度附件的成本大大低于差分干涉對比（DIC）設備的成本。盡管這兩種技術都需要轉臺冷凝器，并且每個物鏡都配有匹配的組件，但配備DIC的顯微鏡還包含冷凝器下方的偏振器和位于光路（物鏡上方）的中間圖像平面之前的分析器。DIC顯微所必需的交叉偏振系統的存在會降低其對偏振光反應的樣品的有效性。

由于樣本不在兩個偏振器之間，所以可以檢查可能混淆DIC中圖像的雙折射對象（巖石薄片，水晶，骨等）。此外，由于極化效應，樣品可以容納在塑料或玻璃容器中而不會使圖像劣化，因為這些容器也在兩個偏振器之上，而不是在它們之間。這使得霍夫曼系統在塑料容器中進行的細胞，組織和器官培養的檢查和顯微攝影中比DIC更有用。

當冷凝器設置在明場位置時，安裝調制器的物鏡也可用于常規明場工作。由于調制器是離軸的，因此圖像的惡化很少。配備調制器的物鏡（但不是狹縫板聚光鏡）也可用于熒光和暗場工作，但在嘗試DIC顯微鏡時應避免這些目標。調制對比系統已經非常成功地用于偏振光顯微鏡以增強樣品中光學梯度和雙折射的檢測。在這個應用中，使用非偏振狹縫，偏振光配置應該是平行偏振器（盡管正交偏振器也會產生良好的結果，盡管照明減弱）。

霍夫曼調制對比系統也有幾個缺點和限制。必須謹慎看待圖像，因為不同的觀察者可以通過目鏡觀察偽三維圖像，從而可以將圖像中的“山”看作是“山谷”，反之亦然。該系統對垂直于狹縫長度的梯度*為敏感，導致需要一定程度的樣本取向技巧以獲得*佳效果。

每個物鏡和冷凝器開口的改造成本必須添加到這些附件本身的基本成本中。復雜的高數值孔徑，多元件物鏡難以修改或太昂貴。近年來，羅伯特霍夫曼的公司Modulation Optics紐約Greenvale（Slant Fin Corporation的全資子公司）一直在生產改良的物鏡和冷凝器。調制光學器件專門修改由*的顯微鏡制造商生產的物鏡。一些目標很容易修改，而有些目標很難或不可能根據調制光學規范進行修改。但是，任何目標都可以與公司的中間管系統一起使用，包括覆蓋微距照相機鏡頭到100倍顯微鏡物鏡的廣泛范圍。該類別還包括設計用于對干燥或浸沒介質（油，水和甘油），單波長和多波長物鏡，反射和透射光物鏡以及經過無限長度或有限長度管校正的物鏡成像的物鏡。

非吸收性樣品不會呈現彩色，除了那些使用含半透明彩色濾光片的特殊調制器代替灰色和黑色區域觀察到的樣品外。自然吸收特定波長或輕度染色的樣本會呈現顏色以及調制對比度和熒光組合或者調制對比度和偏振光組合所觀察到的樣本。

霍夫曼調制對比度顯微鏡的配置非常簡單，基本步驟如下：

透射光中的霍夫曼調制對比度

• 將相關的調制對比度物鏡連接到顯微鏡的鼻鏡上，并安裝包含適當狹縫板的轉塔冷凝器。如果顯微鏡配備了差分干涉對比（DIC）或偏光顯微鏡，請從光路中取出所有偏光器，延遲板以及Wollaston或Nomarski棱鏡。

• 放置一個染色的標本（*好是組織薄片）在舞臺上，并使用10倍物鏡（調制器安裝），對準顯微鏡適當科勒照明，在我們的顯微鏡解剖學部分概述。此操作應將調制對比狹縫板從冷凝器中取出。如果轉塔聚光器有一個用孔徑光闌進行明場照明的位置，則轉動轉盤選擇該聚光器。

• 使用Bertrand透鏡（在偏光顯微鏡上常用），相位望遠鏡或通過簡單地移除目鏡并向下窺視眼管，在物鏡的后焦平面中查看調制器板。確保將樣品從光路上取下或將其移至顯微鏡載玻片上的清晰區域。

• 通過將適當的聚光器（從轉臺）移動到光路中來選擇對應于10倍物鏡的狹縫光圈板。應該有一套調節螺絲或一個杠桿，使得冷凝器內的照明狹縫板能夠旋轉和平移。

• 將圓形偏振濾光片放在冷凝器下方的顯微鏡光端口上。旋轉此濾鏡時，通過Bertrand透鏡（或相位望遠鏡）觀察狹縫圖像，并觀察旋轉角度會影響通過狹縫偏振器部分的光量（亮度）。

• 如圖3（b）所示，平移狹縫的圖像，使得缺少偏振器的開放部分疊加在調制器板的灰色區域上。含有偏振材料的狹縫部分應該在調制器的透明部分正好在灰色區域的右側成像。旋轉圓偏振濾光片，觀察包含偏振材料的狹縫區域是如何出現和消失的。當圓偏振器的振動平面垂直于狹縫中偏振器的振動平面取向時，如果獲得*小化和*大對比度，則獲得狹縫尺寸。這種操作可以使用下面的交互式Java教程來實踐：

• 取下Bertrand鏡頭或相位望遠鏡，并更換顯微鏡眼管中的目鏡。在舞臺上放置一個標本候選人，并將焦點放在10倍物鏡上。

• 通過重新聚焦視場光闌來實現清晰的焦點，重新調節聚光鏡的位置。打開區域光圈，直到它位于視場外。

• 圖像現在已準備好用于觀察或調制對比的顯微攝影。在顯微鏡底部旋轉標本和/或圓形偏光鏡，以獲得*佳對比度。這些設置因樣本而異。

• 每次選擇不同的放大倍數以在調制對比度中觀察樣本時，重復上述步驟。

我們再一次發現，在聚光鏡的前焦平面上（通過偏移狹縫）對光進行處理以及在物鏡（偏移調制器）的后焦平面上對光的處理可以對所呈現的圖像產生顯著影響在目鏡中。