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FRET 技術（Fluorescence Resonance Energy Transfer）能夠在突破傳統光學分辨率極限的條件下研究蛋白互作、構象變化（<10 nm），或者通過構建 FRET 探針監測分子變化，因而在諸多研究領域得到了“科研大拿”們的青睞。然而，傳統的基于熒光強度的 FRET 技術（如 FRET-AB、FRET-SE 等）容易受到熒光蛋白濃度、激光強度、熒光漂白等眾多因素的影響，從而直接導致了實驗結果的不準確性和難重復性，著實讓人頭疼！

△ 圖1. 常用 FRET 染料對 Alexa488-Cy3 的 Jablonski 圖表

FLIM 顯微成像技術

FLIM-FRET 的優勢

FLIM(Fluorescence Life-time Imaging Microscopy) 是一項基于熒光壽命（電子駐留在激發態的時間統計值）的顯微成像技術。與熒光光譜一樣，熒光壽命也是熒光物質的一種內在特有性質，不受熒光物質濃度、激發光強度等因素的影響。基于熒光壽命測量的 FRET 技術—— FLIM-FRET，具有 FLIM 和 FRET 兩者的優勢，即能在不受熒光強度影響因素影響的條件下，在納米分辨率水平對蛋白互作進行研究，或者通過 FRET 探針研究分子環境變化，更重要的是其測量數據準確性高、易重復，接下來我們來看兩個例子。

案例解析

案例一

離子溶度監測

今年發表在 Nature Immunology 上的文章 “An essential role for the Zn2+ transporter ZIP7 in B cell development” 研究了 ZIP7 蛋白在 B 細胞中的重要作用。

作者通過對免疫缺陷病人進行基因篩查，發現了 ZIP7 蛋白的缺失，利用 CRISPR-CAS9 技術構建了該基因缺失的小鼠模型，并利用該模型證明了 ZIP7 缺失會導致 B 細胞發育受阻。ZIP7 介導 Zn²⁺ 由內質網流入細胞質，為了證明 ZIP7 缺失的細胞中 Zn2+ 濃度受到了影響，作者通過 FRET 探針 eCALWY-4、eCALWY-6 進行了研究，然而傳統的FRET技術會受到探針濃度的影響從而導致結果不準確，因此作者利用了 FLIM-FRET 技術，證明 ZIP7 突變體細胞質中 Zn2+ 濃度明顯下降，后續的實驗進一步證明了 ZIP7 調控的 Zn2+ 水平對 B 細胞發育的重要性。

△ 圖2. 利用 FLIM-FRET 技術檢測細胞質和內質網中 Zn2+ 濃度。P198A Hom，ZIP7 突變體；eCALWY-4、eCALWY-6 ，Zn²⁺  FRET reporters ; ER，內質網

案例二

活體功能成像

FRET 探針不僅可用在細胞水平，in vivo 個體水平也同樣適用。

“Removing physiological motion from intravital and clinical functional imaging data” 一文利用 Rac1 FRET 探針對小鼠小腸、胰腺等組織中的 Rac1 活性進行了監測。然而，傳統的 FLIM 技術成像速度非常慢，在活體應用時，由于時間分辨率不夠會導致數據的假象。該文通過算法將這種成像速度不夠導致的假象進行了*大程度的消除，從而在一定程度上促進了 FLIM 在活體水平的應用，該文章發表在2018年 eLife 雜志上。

△ 圖3. 左，Rac1 FRET 探針檢測小腸隱窩處 Rac1 活性模式圖；右，運動補償運算前后 FLIM 數據對比

SP8 FALCON *快速熒光壽命成像

解決 FLIM 成像速度*大瓶頸

當然， FLIM 應用并不僅限于 FLIM-FRET，通過 FLIM 還可以對樣本所處的微環境進行檢測、對樣品組份進行分離等等。在傳統的熒光強度和熒光光譜兩個維度的基礎上，又增加了熒光壽命這一新的成像維度，大大拓展了該系統的應用范圍。

然而，正如 Sean C Warren eLife 文章所說，FLIM 成像速度慢是限制其應用的*大瓶頸。

Leica*新 SP8 FALCON *快速熒光壽命成像解決方案，使 FLIM 成像速度提升了近10倍（較經典 TCSPC 方法），近共聚焦的成像的速度幾乎能滿足所有動態過程的速度要求，可輕松實現 XYZTλ 多方式快速熒光壽命成像。