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如何利用正確的物鏡校正立體顯微鏡中的像差

消除液體浸沒或嵌入樣品/樣品的折射率不匹配

對于浸沒在液體中或嵌入聚合物中的樣品/樣品，由于球面像差，可能妨礙高質量的顯微鏡觀察?？諝馀c樣品的液體或嵌入介質之間的折射率不匹配是導致圖像失真的這種像差的原因  [1]。像差可能使得難以準確地觀察樣品的某些特征。對于用光學顯微鏡（立體或復合）觀察浸沒或嵌入樣品的用戶，可以校正折射率失配的物鏡允許獲得具有大大減小的球面像差和更清晰焦點的圖像。

背景

立體顯微鏡具有提高的分辨能力的一個缺點是觀察和記錄不直接暴露于空氣的樣品/樣品變得更加困難，例如嵌入聚合物（例如電子元件）或浸沒在液體中的樣品/樣品（例如，水生生物）。當觀察浸入水溶液中的樣品時，樣品的精細結構和特征往往看起來模糊，特別是在高放大倍數值下。

這種模糊或圖像失真是由球面像差引起的。像差是由空氣（n = 1）和水（n = 1.3）的折射率差異引起的，稱為折射率不匹配 [1]。有趣或重要的結構很容易被遺漏或忽略，因為立體顯微鏡的“正常目標”可能會出現球面像差，這些像素被優化用于直接暴露在空氣中的樣品（無浸沒或嵌入介質）。對于使用“z-堆疊”軟件功能創建的3D合成圖像，像差尤其明顯，因為結構在z方向上看起來是細長的。

對于復合顯微鏡也會出現相同的現象，但是存在液體浸漬化合物物鏡，其可以與鏡片和樣品之間的液體層一起使用。通常，浸沒液體是水或油，這些有助于顯著減少上述圖像像差。

用于立體顯微鏡的Leica Plan Apo 2x物鏡于2010年推出。由于有效數值孔徑為0.35，它實現了1,050線對/ mm（可見光為952 nm）的分辨率。與早期的顯微鏡系統相比，這種分辨率的提高部分歸功于FusionOptics  [2]。FusionOptics技術利用非對稱變焦鏡頭，為立體顯微鏡用戶提供觀察樣本（通過目鏡）的最佳3D感知，并具有最高分辨率和相應的景深。不幸的是，當使用Plan Apo 2x物鏡對浸入式或嵌入式介質進行成像時，可能會出現球面像差問題。

用作脊椎動物胚胎發育模型系統的水生生物的研究，如斑馬魚，仍然需要更高的分辨率，更好的光傳輸和更好的信噪比（S / N）性能。對于具有立體顯微鏡的熒光應用，這種需求尤其如此。當使用針對暴露在空氣中的樣品進行優化的這種高分辨率物鏡時，在次優條件下觀察并記錄明顯嵌入和浸沒的樣品以及帶有蓋玻片的樣品。

消除圖像像差

存在具有“校正環”的顯微鏡物鏡，其允許調節透鏡浸沒介質與樣品浸沒或嵌入介質之間的折射率的不匹配。校正環的調整導致物鏡內的一組透鏡的位置發生偏移。目標項圈如何校正折射率不匹配的說明如圖1所示。

物鏡的校正環使用戶能夠消除球面像差并獲得嵌入（聚合物或玻璃）或液體浸入（水）樣品/樣品的圖像，具有更清晰，更清晰的焦點。在校正與物鏡軸的折射率不匹配之后，似乎不存在浸沒或嵌入介質。適當調整物鏡校正環提高了空間分辨率和圖像的S / N比。

具有校正環的立體顯微鏡物鏡的示例是Leica Plan Apo 2x Corr物鏡。使用Leica Plan Apo 2x Corr，即使是厚的嵌入樣品或浸入深水溶液（5 mm）中的樣品也可以成像很少或沒有像差。

應用實例

許多用戶使用立體顯微鏡檢查或記錄嵌入式和液體浸沒的樣品/樣品。以下示例演示了使用具有Leica 2x Plan Apo Corr物鏡的立體顯微鏡時的圖像質量改善（假設正確設置和調整）。

樣品/樣品浸入水溶液中

牛肺動脈內皮（BPAE）細胞被用作心血管功能和疾病研究的模型系統  [3]。使用熒光FluoCells牛肺動脈內皮（BPAE）圖像細胞®，的MitoTracker ®紅，CMXRos，BODIPY ® FL phallacidin和DAPI（分子探針，萊頓，荷蘭）在圖2中看到他們用獲得的徠卡M205 FA立體顯微鏡，Leica 2x Plan Apo物鏡或Leica 2x Plan Apo Corr物鏡，Leica DFC3000G數碼相機和LAS X軟件。

在圖2A中，僅具有phallacidin通道的熒光圖像和用Leica 2x Plan Apo物鏡（無校正環）捕獲的明視場圖像。該BODIPY ®  FL phallacidin污漬選擇性的F-肌動蛋白絲。獲取圖像Z-堆棧并顯示每個堆棧的最清晰圖像。沒有應用圖像處理算法，因此這些圖像顯示原始數據。

在圖2B中，使用Leica 2x Plan Apo Corr物鏡捕獲圖像，其中校正環設定為0.25mm以補償包埋介質和蓋玻片。通過在略微不同的設置下目視觀察和比較用校正環獲得的一系列Z-堆疊來識別校正環的最佳位置。圖像清楚地顯示了校正環上的正確設置對圖像質量的差異。細胞中的肌動蛋白絲結構變得更加可見并且S / N比得到改善。與大多數類型相比，BPAE細胞樣本非常薄。

樣品嵌入聚合物中

市售的發光二極管傾向于嵌入聚合物中以供實際使用。嵌入聚合物中的LED的圖像顯示在圖4中。它們是用Leica M205 FA立體顯微鏡，Leica 2x Plan Apo物鏡或Leica 2x Plan Apo Corr物鏡，DFC450數碼相機和LAS X軟件獲得的。

在圖4A中，使用Leica 2x Plan Apo物鏡（無校正環）捕獲的明場圖像?？梢钥吹絃ED的各個部分。獲取圖像Z-堆棧并顯示每個堆棧的最清晰圖像。沒有應用圖像處理算法，因此這些圖像顯示原始數據。

在圖4B中，使用Leica 2x Plan Apo Corr物鏡捕獲圖像，其中校正環設置為2 mm以補償塑料。如前所述，通過在略微不同的設置下目視觀察和比較用校正環獲得的一系列Z-堆疊來識別校正環的最佳位置?？梢钥吹綀D像質量的明顯差異。LED段聚焦清晰，S / N比提高。

概要

由于空氣與樣品或樣品的液體或嵌入介質（例如聚合物）之間的折射率不匹配而導致的球面像差會降低顯微鏡觀察的質量  [1]。觀察期間樣品的特定特征可能會變形。用于觀察浸入或嵌入樣品的光學顯微鏡（立體或復合）用戶可以通過使用校正折射率失配的物鏡來避免像差和圖像失真。