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相差顯微鏡的原理

光波三要素：頻率，代表光的波長或顏色；振幅，代表光的強度；相位，代表波的相對位移。

光在穿過非真空的介質時，會發生振幅和相位的改變。其中，振幅的改變取決于介質對于光的吸收和散射，通常與光的波長，也就是顏色有關。成像設備和人類的肉眼只能感受到振幅的變化。對于透明的生物細胞樣本，光在透過樣本后，振幅基本無變化，因此肉眼很難觀察到。

相位的改變包含很重要的信息，但是不能被直接觀察到。

在相差顯微鏡出現之前，人們要觀察透明細胞時，需要對細胞進行染色，才能被觀察到。這就需要特殊的染色操作，并且細胞也會死亡。相差顯微鏡就可以觀察未經染色的透明細胞，可以保持細胞形態和特征。

相差成像技術在1953年獲得了諾貝爾獎，所以，應用相差技術的相差顯微鏡也算是星二代啦~

環形照明光（綠色）通過聚光鏡聚焦到樣本，部分光被樣本散射（黃色），其余的光沒有變化，穿過樣本形成背景（紅色）。

當樣本沒有染色時，散射光會很弱，而且通常與背景光有-90度的相位差。此時前向光與背景透射光強度非常接近，因此反差很小，不易觀察。

在相差顯微鏡中，物鏡后方會有一個相差環，使樣本的散射光產生-90度相位變化，與散射光和背景光同向，從而增大前向光與背景光反差。

通過第二個灰度濾光片，使散射光和背景光都有一定程度降低，由于背景光降低的程度比散射光降低程度大，因此前向光與背景光反差進一步增大，更容易被觀察到。

以上是負相差，前向光比背景光強，視野內樣本成像比周圍背景亮。

目前相差顯微鏡通常采用正相差。正相差與負相差相反，是使背景光產生-90度相位變化，背景光與散射光方向相反，前向光比背景光暗，樣本細節成像更明顯。

倒置顯微鏡常配置相差成像技術，用于透明的生物細胞觀察。相差成像對細胞容器沒有特殊要求，塑料培養皿即可，便于培養細胞的連續觀察。

相差成像技術中，樣本周圍會產生“光暈”，尤其是在比較大的顆粒如整個細胞周圍，使圖像產生混亂。但“光暈”也可以增強樣本與背景的差異，尤其是增強薄的邊緣的細節反差。