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奧林巴斯顯微鏡專業(yè)技術(shù)知識

當(dāng)在光學(xué)顯微鏡中對樣品進行成像時，強度和/或顏色的差異會產(chǎn)生圖像對比度，這使得樣品的各個特征和細節(jié)變得可見。對比度定義為圖像和相鄰背景之間的光強度相對于整體背景強度的差異。通常，人眼需要0.02（2％）的最小對比度值來區(qū)分圖像和背景之間的差異。對于其他檢測器，如膠片，攝像機或光電檢測器（CCD和CMOS設(shè)備），最小對比度通常是不同的值。對于每個檢測器，信噪比（噪聲是光學(xué)系統(tǒng)中沒有圖像信息的所有光）必須足夠大以根據(jù)形成相干圖像來解釋。

通過吸收光，亮度，反射率，雙折射，光散射，衍射，熒光或顏色變化而在樣品中產(chǎn)生的對比度已經(jīng)成為在明視野顯微鏡下成像樣品的經(jīng)典手段。細節(jié)突出背景或其他相鄰細節(jié)的能力是樣本對比度的度量。就一個簡單的公式而言，對比可以描述為：

對比度（C）=（（I（s）-I（b））×100）/ I（b）

其中I（b）是背景的強度和I（小號）是試樣的強度。從這個等式中可以看出，樣本對比度是指圖像中最高和最低強度之間的關(guān)系。圖1所示的圖表說明了背景強度對比度的影響。當(dāng)背景是非常暗的灰色（I（b）等于0.01）時，圖像強度的微小變化會導(dǎo)致對比度的巨大變化。通過將背景變淺為稍淺的灰色（I（b）等于0.10），圖像強度的小改變提供了有用的對比度范圍。在更輕的背景色（I（b） > 0.20），圖像對比度對背景強度相對不敏感，而I（b）的較大變化僅產(chǎn)生圖像對比度的小幅增加或減少。

雖然在現(xiàn)代顯微鏡中發(fā)現(xiàn)的光學(xué)系統(tǒng)可能能夠在高放大率下產(chǎn)生高分辨率圖像，但如果圖像中沒有足夠的對比度，則這種能力是毫無價值的。對比度不是樣本的固有屬性，而是取決于樣本與光的相互作用以及光學(xué)系統(tǒng)的效率，以及其與檢測器可靠記錄此圖像信息的能力。顯微鏡光學(xué)系統(tǒng)中圖像對比度的控制取決于幾個因素，主要是光圈光闌的設(shè)置，光學(xué)系統(tǒng)中的像差程度，采用的光學(xué)對比系統(tǒng)，樣本類型和光學(xué)檢測器。顯微鏡中有幾個可以調(diào)節(jié)對比度的部位。這些包括場孔，聚光器孔徑，

由于人眼通過圖像中產(chǎn)生的對比度來感知物體，因此人們很容易就會誤入歧途，除非知道在圖像中產(chǎn)生對比的光學(xué)事件。圖2顯示了相同視場的三個顯微照片，其包含在不同對比模式下用光學(xué)顯微鏡成像的透明，無色人臉頰細胞：明場，相襯和霍夫曼調(diào)制對比度。很明顯，這三幅圖像顯得不同，并且由于這些變化，顯微鏡專家可能會從每個視場得出不同的結(jié)論。圖2（a）中顯示的細胞用顯微鏡在明場模式下操作成像，聚光器光圈足夠關(guān)閉以使樣品邊緣可見。

圖2（b）顯示了使用相差光學(xué)元件的臉頰細胞的相同視場。注意黑暗的內(nèi)部區(qū)域和圍繞物體邊緣的明亮外部區(qū)域，如細胞膜和細胞核（稱為暈圈，并且是偽像）。在這個視圖中，很難指定單元格的邊緣并解釋圖像中暗區(qū)和亮區(qū)的原因。細胞也顯得很平坦。最后，圖2（c）所示的細胞使用Hoffman調(diào)制對比度成像，其中圖像的一側(cè)是黑暗的，而其相反側(cè)是明亮的，導(dǎo)致偽三維物體的感知。圖2中的每個視場提供了不同的標本圖像，并導(dǎo)致了不同的解釋，只能通過關(guān)于顯微鏡如何創(chuàng)建這些圖像的知識來解譯這些解釋。

對于光學(xué)顯微鏡中的許多標本，尤其是未染色或活體材料，對比度非常差，以至于標本基本上保持不可見，而不管目標是否能夠解決或清楚分離細節(jié)。通常，對于這樣的標本，重要的是不要通過殺死或用化學(xué)染料或固定劑處理來改變它們。這種必然性使得顯微鏡專家們嘗試了超過百年的對比度增強技術(shù)，試圖改善樣品的可見性，并在不改變樣品本身的情況下為圖像帶來更多細節(jié)。通常的做法是將聚光器孔徑光闌減小到推薦的尺寸以下，或降低平臺聚光器以增加試樣的對比度。不幸的是，雖然這些演習(xí)確實會增加對比度，

在討論光學(xué)顯微鏡控制對比度的方法之前，考慮光線和物質(zhì)如何相互作用的特性很有用。負責(zé)照亮樣品的光可以是空間相干的，不相干的或部分相干的。例如，光束可以以狹縫或環(huán)形的形式成形，并且可以由在垂直于傳播方向的所有方向上振動的選定波長或由于偏振而在單個方向上振動。

一些標本被認為是幅度物體，因為它們部分或完全吸收光線，因此可以使用傳統(tǒng)的明場顯微鏡容易地觀察到。其他天然彩色或用化學(xué)染料人工染色的其他顏料也可以用顯微鏡清晰地成像。這些污漬或自然色吸收部分穿過的白光，并透射或反射其他顏色。通常情況下，染色結(jié)合產(chǎn)生對比色，例如藍色蘇木精染色細胞核結(jié)合粉紅色伊紅胞質(zhì)。在不容易吸收光線的標本上使用污漬是一種常見做法，因此可以使這些圖像在眼睛上可見。

其他標本不吸收光并被稱為相位對象。由于人眼只能檢測強度和顏色差異，因此必須將物體引起的相位變化轉(zhuǎn)換為強度差異。相樣品的特征包括幾個標準，包括它們的形狀（通常是圓形或平面），內(nèi)部光散射元件的密度，厚度以及獨特的化學(xué)或電學(xué)結(jié)構(gòu)特性（統(tǒng)稱為折射率）。厚的樣本可能比較清晰，只包含少數(shù)光散射元素，或者它們可能含有許多不透光的散射元素，使樣本對傳輸?shù)恼彰饔行Р煌该鳌＿@些標本通常被稱為反射光標本。

當(dāng)考慮光學(xué)方法來增強樣本對比度時，考慮樣本的各種特征是有用的，可以對樣本進行處理以創(chuàng)建這些特征的強度變化以使其可見。一個主要問題是，在一組獨特的環(huán)境下，物體的哪個特征會轉(zhuǎn)變?yōu)椴煌膹姸取?/span>

只要試樣與其周圍介質(zhì)（周圍環(huán)境）之間存在折射率差異，試樣的細節(jié)和邊緣的大小接近成像光的波長將衍射或散射光。 折射率定義為光通過空氣或真空的速度除以通過物體的光速的比率。由于通過任何材料的光速小于光在真空中的速度，對于用顯微鏡檢查的樣品，折射率總是超過1.0的值。為了解決物體之間的小距離并以合理的保真度重現(xiàn)其形狀，必須通過顯微鏡物鏡捕獲大角度的衍射光。

由物鏡聚集衍射（或偏離）光必須被帶入在圖像平面上的銳聚焦，以便產(chǎn)生樣本詳細地，如在圖3中示出。在圖像平面，包括衍射光的光波經(jīng)受干擾與非衍射光。干涉后光線的可見度很大程度上取決于照射樣品的光的相干性，通過增加相干性，可見度逐漸增加。在光學(xué)顯微鏡中，聚光器孔徑光闌開口大小控制撞擊在樣品上的光的空間相干性。減小光闌開口尺寸會產(chǎn)生更大的空間連貫性。

顯微鏡專家長期以來一直依靠減小聚光器孔徑光闌開口尺寸來增加相樣品中粒子和邊緣的可見度。振幅對象的對比度也可以通過適當(dāng)調(diào)整聚光器孔徑來改善。小物體，邊緣和微粒將衍射光線，無論它們屬于振幅還是相位樣本。由于物鏡的數(shù)值孔徑限制，只有一部分衍射光被物鏡捕獲（見圖3）。未收集的剩余衍射光代表丟失的圖像信息。聚光器孔徑光闌開口尺寸的正確設(shè)置是試樣圖像對比度增強和衍射偽影引入之間的折衷。這些表現(xiàn)在分辨率的喪失，衍射環(huán)的疊加以及源自樣本中不共同聚焦的區(qū)域的其他不期望的光學(xué)效應(yīng)。隨著衍射極限逼近，隨著物體細節(jié)變小和空間頻率變大，圖像對比度變得更低。

Inoué和Spring將圖像對比度與樣本對比度以及實際和理想化正弦圖像占據(jù)位置的相移比作為光學(xué)傳遞函數(shù)（OTF）描述為空間頻率的函數(shù)。在來自試樣的光的分布變?yōu)檎业那闆r下，光學(xué)傳遞函數(shù)的模量變成調(diào)制傳遞函數(shù)（MTF）。隨著空間頻率的增加，調(diào)制傳遞函數(shù)減小，樣本對比度降低。

對于每個目標，具體的調(diào)制傳遞函數(shù)取決于客觀設(shè)計和數(shù)值孔徑，對比產(chǎn)生的模式，照明光的波長以及子電容器的數(shù)值孔徑。物鏡后焦平面的邊緣作為衍射光的低通濾波器，必須將其聚焦在像平面才能發(fā)生干涉，并形成粒子或邊緣的圖像。聚焦顯微鏡將這些衍射光波在中間像平面處聚集在一起。光波前相對于樣本的角度決定了聚焦在通常不包含衍射位置的平滑圓形表面的頂部或底部上的難度。然而，

在討論相樣本時，我們將定義一個對象作為樣本的任何可分辨部分。如圖4所示，許多物體將是平坦的或板狀的。在該圖中，物體具有厚度（t）和折射率n（s）。周圍介質(zhì)的折射率是n（m）。

光通過OP = t（n（s））光路穿過樣本，并通過光路OP = t（n（m））的周圍介質(zhì)。光程差（OPD）可以表示為：

OPD =（tn（s）-tn（m））= t（n（s）-n（m））

相位差是：

δ=（2π/λ）（OPD）

其中π是常數(shù)（3.14159265），λ是照射樣本的光的波長。光程差是兩個項的乘積：厚度（t）和折射率差（n）。即使物體的厚度很薄，OPD通常也可能很大。另一方面，當(dāng)樣本和周圍介質(zhì)的折射率相等時，即使樣本厚度非常大，OPD也為零。在這種情況下，穿過物體的光只是相對于通過相同厚度環(huán)繞的光延遲（相位差）。人眼無法檢測到相位差異。

在相差顯微鏡被設(shè)計為采取的試樣中，并在周圍介質(zhì)中的對象之間的相位差的優(yōu)勢。然而，這不僅僅是必要的相位差，而且相差顯微鏡也必須發(fā)生衍射。

相位對象最常見的形狀是連續(xù)變化的光路或密度之一，例如圖5所示的半球形樣本。在這種情況下，相位對象的邊可以通過棱鏡形狀在數(shù)學(xué)上近似，如下所述。圖5中的相位對象的折射率被指定為n（s），而周圍介質(zhì)的折射率被指定為n（m）。相位對象在形狀上的基本幾何過渡只發(fā)生在邊緣A和B（見圖5（a））。入射光影響垂直于平面AB的物體，而平面波前平行于AB。

1處的邊界（圖5（a）中圓形相位物體的頂點）基本上平行于入射波陣面，而A和B處的邊界是垂直的。區(qū)域2到4是由相位對象的圓形表面的切線定義的微型棱鏡（圖5（b））。區(qū)域2處的“棱鏡”角度小于區(qū)域4處與區(qū)域4'相反的角度。在邊緣A和B處，衍射最強。

因此，彎曲的物體由許多棱鏡組成，并且物體的相對側(cè)具有以相反方向取向的棱鏡。最陡的棱鏡位于球形物體的赤道上，而斜率最小的棱鏡位于頂部和底部。這些微型棱鏡形成了一個光學(xué)梯度：

OG（光學(xué)梯度）=Φ=α（n（s）-n（m））

其中α是切線相對于平面波前的角度。請注意，光學(xué)梯度是兩項的乘積：光通過的兩側(cè)之間的角度（α）與折射率的差異（n（s） - n（m））。穿過棱鏡的光線以角度Φ改變方向（見圖5（c）和5（d））。如果折射率的差異很大，則即使斜率或邊界梯度可能較小，但方向的變化可能較大。如果折射率相同，則光波穿過沒有折射的相位物體。從棱鏡射出的光線的方向取決于相位物體（n（s））與其周圍介質(zhì)（n（m））之間折射率的相對差異;見圖5（c）和5（d））。

如上所述，圓形物體具有連續(xù)變化的光學(xué)梯度，并且每個單獨的光學(xué)梯度“棱鏡”產(chǎn)生不同的光偏轉(zhuǎn)角度。圖5（c）示出了當(dāng)周圍介質(zhì)的折射率大于相位對象（n（m）> n（s））時的偏轉(zhuǎn)方向，并且圖5（d）示出了相反的情況下的方向n（m）<n（s））。偏轉(zhuǎn)角Φ與切角（α）和折射率差（n（s）-n（m））成正比，因此：

tanΦ=tanα（n（s）-n（m））

對于小角度：

Φ=α（n（s）-n（m））（以弧度表示）

為了總結(jié)光學(xué)梯度邊界的“棱鏡”效應(yīng)，當(dāng)相位物體的折射率超過周圍介質(zhì)的折射率時，物體的每個斜面上相同大小的梯度以相同的角度偏轉(zhuǎn)。該偏轉(zhuǎn)角取決于相對折射率差和幾何切線角（α）。當(dāng)介質(zhì)的折射率（n（m））大于物體的折射率（n（s））時，偏離情況相反。當(dāng)沒有梯度時，光線不會發(fā)生偏轉(zhuǎn)。

光可以通過各種機制與樣本相互作用以產(chǎn)生圖像對比。這些包括表面反射，吸收，折射，偏振，熒光和衍射。對比度也可以通過對顯微鏡光學(xué)元件和照明模式進行物理修改以及通過照相或數(shù)字電子技術(shù)操作最終圖像來增加。下面的討論重點介紹了樣本和光線之間的各種相互作用，并回顧了一些為增強樣本對比度而開發(fā)的光學(xué)顯微鏡技術(shù)。

當(dāng)入射光照射到不透明表面時，它將以特定于該表面地形的方式反射。非常光滑的表面以等于入射光的角度反射光線，這種機制稱為鏡面反射。不均勻或漫反射表面傾向于通過稱為漫反射的現(xiàn)象在所有可能的角度反射光，導(dǎo)致進入目標的光量減少。反射光顯微鏡的對比度可以通過仔細制備標本來加強。通常用反應(yīng)性液體和氣體蝕刻金相樣品以顯示晶界和/或拋光以增加反射到顯微鏡中的光量。熒光染料，薄膜和金屬涂層形式的污漬也用于在反射光顯微鏡樣本中引入對比度。雙折射標本可以使用偏振反射光成像，透明相物體通常是使用反射微分干涉對比度，暗場照明和霍夫曼調(diào)制對比等技術(shù)進行觀察的對象。

人眼對樣本中的振幅和波長差異非常敏感。由于這個原因，許多標本被切成非常薄的部分（厚度從1-30微米）并用化學(xué)染料染色以增加對比度并區(qū)分位于標本內(nèi)的結(jié)構(gòu)。這種技術(shù)在生物樣本中已經(jīng)相當(dāng)普遍地使用了幾百年。染料有選擇地吸收一個或幾個波長的光線，并通過或反射所有其他波長。一個例子是吸收所有可見光波長的藍色染料，藍色除外，藍色反射并透過樣品。生物樣本的內(nèi)部結(jié)構(gòu)元件通常用染料混合物染色以選擇性地染色這些元素，

這些技術(shù)也適用于熒光染料，可用于提高標本高對比度的特異性。當(dāng)熒光標本被一種波長的可見光或近紫外光刺激時，它們通常會發(fā)出較長波長的光，從而相對于現(xiàn)場或背景中的其他物體（圖6）變得可見或?qū)Ρ取晒怙@微鏡的技術(shù)在顯微鏡底漆的另一部分中詳細討論。