由于不正確地使用光源，所有頻繁，精密且裝備精良的顯微鏡不能產生出色的圖像，這通常導致樣品照明不足。 經過優化后，樣品的照明應該明亮，無眩光，并均勻分散在視野內。
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有許多光源可用于照明顯微鏡，無論是常規觀察還是關鍵顯微攝影。由于其低成本和長壽命，最常見的光源是50或100瓦鹵鎢燈，如圖1顯微鏡圖的底部所示，其還詳述了典型的現代透射光顯微鏡中的光學路徑。在該圖中，鹵鎢燈發出以3200K為中心的連續光譜（當設置在+9伏的燈電壓下），然后在反射到分屏電容器之前通過集電極和場鏡，并且到樣品上。成像光線被顯微鏡物鏡捕獲，并通過目鏡或通過分光鏡指向幾個相機端口之一。在整個顯微鏡的光學路徑中，照明通過一系列光闌和透鏡進行定向和聚焦，因為它從光源傳播以照亮樣本，然后進入目鏡或相機附件。遵循科勒照明規則，實現顯微鏡光學元件的對準以優化現代顯微鏡的照明。有關透射光和反射光顯微鏡如何針對柯勒照明進行對準的更多細節將在我們為透射光和反射光設置顯微鏡的章節中討論。上面圖1所示的光學路徑對于透射光顯微鏡是典型的，并且涉及許多透鏡，光闌，反射鏡和分束器，以通過顯微鏡引導光。
鎢鹵燈相對較亮，色譜中心為3200 K（設置在約+9伏時），但需要使用顏色轉換濾光片將其色溫升至日光等值。另一種流行的光源是75到150瓦的氙氣燈，因為它具有非常高的亮度和長壽命，整個可見光譜的輸出相對均勻，并且色溫接近日光膜乳劑所要求的。在需要非常高的光強度的情況下，經常使用鹵化錫燈。在熒光顯微鏡中，特別是用于關鍵顯微攝影的目的，通常使用100瓦或200瓦的汞燃燒器。在過去的幾年中，碳弧燈或鋯球可能已被使用，但這些來源在今天很少見到。欲了解更多信息和可用于顯微鏡照明的廣泛燈具的詳細討論，請訪問我們的顯微鏡和顯微攝影光源部分。
在反射光學顯微鏡中通過光學路徑對源照射進行對準也是主要關注的問題，特別是在金相學，半導體晶片檢測以及熒光顯微鏡中取得的顯著新進展方面。反射光顯微鏡也用各種光源照射（如上所述），并可使用科勒照明進行調節以獲得最佳性能。這在我們關于克勒反射光顯微鏡照明配置的章節中有更詳細的討論。反射光顯微鏡的照明路徑也是幾個交互式Java教程的主題，包括直接在下面鏈接的教程。
John Delly在其杰出書籍“通過顯微鏡攝影”中指出，80％到90％的提交給比賽，展覽和科學出版物的顯微照片是不正確對準的光學元件的受害者，導致樣品照射不良。這是一般顯微鏡和顯微攝影術中最常見的問題之一，許多大學實驗室對學生顯微鏡的突然檢查將揭示大量調整不佳的聚光鏡和照明光源。我們懷疑在給定顯微鏡的整個物鏡范圍內，底座聚光鏡和視場光闌的不正確對準和調整是顯微攝影術中最大的誤差來源。
適當照明的必要性怎么強調也不為過。通常情況下，25,000美元的顯微鏡通過不正確的照明和對準降低到手放大鏡的水平，從而導致在科勒照明的最佳條件下用超過2000美元的顯微鏡拍攝的顯微照片。本白皮書的配套部分涉及科勒照明理論及其實現（透射光和反射光），我們討論了顯微鏡配置的關鍵方面，并且包含了各種交互式Java教程，以幫助學生掌握這些重要概念。
無焦點或非焦點照明 - 在光路中的某一點不形成光源圖像的照明系統稱為無焦點或非焦點照明。在電燈泡發明之前，顯微鏡專家在選擇合適的顯微鏡照明光源方面受到限制。在白天，他們可以將自己的顯微鏡（或反射鏡反射鏡）指向天空，并使用云層作為原始擴散屏幕，將照明均勻地散布在整個視野內。儀器制造商還研磨鏡面以產生凹面反射表面，以努力增加物體面內的光強度。云層和藍天不是光源，它們可以很容易地在顯微鏡的光學路徑內成像，因此是無焦照明的來源。室內和夜間工作迫使早期的顯微鏡專家依靠人工照明源，由于這些源產生的固有較低的色溫，使得樣品顏色以不同于在自然日光下觀察到的不同強度，色調和色調。為了彌補這一點，顯微鏡專家們已經使用各種類型的藍色濾光片來改變人造光的表觀色溫以緊密匹配自然日光的色溫。但是，如果不在光路內某處形成光源圖像，這些各種早期照明方法仍然屬于無焦點或非焦點照明的范疇。
早期的調查顯示，當在日光和人造光源之間旋轉時，如果物鏡的后透鏡完全充滿光線，則（實際上）在圖像的光學特性或分辨能力方面沒有明顯變化。后來，科學家發現最重要的要求是照明的數值孔徑至少要等于物鏡的數值孔徑。在19世紀，開發了新的照明源，并開發了一種新的“源聚焦”（后來稱為臨界或尼爾森照明）方法來改善顯微照明條件。
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臨界（或納爾遜）照明 - 這種顯微鏡照明方法首先由英國顯微專家Edward Nelson根據Ernst Abbe先進光學原理開發而成。納爾遜光照被十九世紀后半期的顯微鏡專家非常成功地運用到二十世紀。今天，仍然有一些關鍵照明的倡導者繼續使用需要外部光源的顯微鏡，或者在顯微攝影不是問題的便宜的學生顯微鏡中使用它。
尼爾森照明依賴于使用亞平臺聚光鏡在樣品平面上從燃燒的油燈（或其他均勻光源）產生火焰的聚焦圖像，以在整個視場中實現均勻的照明條件。考慮這種照明方法時，光源的均勻性是重要的方面。由燃燒燈產生的火焰相當均勻一致，但其他來源如磨砂放大器燈泡，蛋白石燈泡或帶狀燈絲也可用于臨界照明。圖2說明了使用提供均勻照明源的假想油燈的臨界照明的光學路徑。
油燈火焰發出的光線必須通過底座聚光器聚焦，以便在微型滑板的樣品平面產生火焰圖像。實際上，在火焰的中心部分找到焦點通常是困難的（或不可能的），所以火焰的“邊緣”通常聚焦在后續鏡子的重新調整之后，使得圖像的中央部分火焰填滿了視野。進入顯微鏡的光量可以通過視場光闌來控制，視場光闌通常附著在外部（如果有的話）。必須有足夠的光線進入顯微鏡才能完全填滿物鏡的背面，并且可以通過適當調整聚光器孔徑光闌來控制這一點。將光源聚焦在樣品平面上是不穩定的，并且通常會產生粒狀，不均勻或有斑點的背景。這可以通過稍微散焦下聚光鏡來產生更均勻的背景來克服。納爾遜照明在很大程度上被更高效的克勒照明顯微鏡方法所取代。
柯勒照明 - 本主題的另一部分將對此主題進行更詳細的討論，但我們將簡要介紹這里的主要方面。在科勒照明中，光源的圖像聚焦在聚光器孔徑光闌處，從而通過樣本或物體的平面產生平行（并且未聚焦）的光。聚光器下方（孔徑光闌處）的光源放大圖像會產生一個寬光錐，這對于樣品的最佳分辨率是必需的。聚光器孔徑光闌的尺寸可以用來控制照亮樣品的光錐的數值孔徑，并減少不必要的雜散光和眩光。另外，聚光鏡的玻璃表面上的灰塵和其他缺陷的成像被最小化。
高效的樣品照明非常依賴顯微鏡中所有光學元件（包括照明光源）的正確對準。嚴肅的顯微鏡專家應該熟悉每個部件的調整范圍，并且應該將這些與不同的樣品和物鏡對齊。不均勻的照明會嚴重影響顯微照片的質量，導致“熱點”，漸暈，色邊，對比度差以及各種其他不良影響。一些最新的顯微鏡配備了不允許調節的“預先居中”燈，有些甚至供應沒有橫向調節機構的聚光鏡。在進行顯微攝影之前，確保這些顯微鏡在工廠進行適當的科勒照明是很重要的。仔細閱讀顯微鏡說明手冊和/或詢問您的工廠技術代表，了解關于這些顯微鏡如何針對照明進行優化的重要細節。
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