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利用物鏡校正立體顯微鏡中的像差

消除液體浸沒或嵌入樣品/樣品的折射率不匹配

對(duì)于浸沒在液體中或嵌入聚合物中的樣品/樣品，由于球面像差，可能妨礙高質(zhì)量的顯微鏡觀察。空氣與樣品的液體或嵌入介質(zhì)之間的折射率不匹配是導(dǎo)致圖像失真的這種像差的原因  [1]。像差可能使得難以準(zhǔn)確地觀察樣品的某些特征。對(duì)于用光學(xué)顯微鏡（立體或復(fù)合）觀察浸沒或嵌入樣品的用戶，可以校正折射率失配的物鏡允許獲得具有大大減小的球面像差和更清晰焦點(diǎn)的圖像。

背景

立體顯微鏡具有提高的分辨能力的一個(gè)缺點(diǎn)是觀察和記錄不直接暴露于空氣的樣品/樣品變得更加困難，例如嵌入聚合物（例如電子元件）或浸沒在液體中的樣品/樣品（例如，水生生物）。當(dāng)觀察浸入水溶液中的樣品時(shí)，樣品的精細(xì)結(jié)構(gòu)和特征往往看起來模糊，特別是在高放大倍數(shù)值下。

這種模糊或圖像失真是由球面像差引起的。像差是由空氣（n = 1）和水（n = 1.3）的折射率差異引起的，稱為折射率不匹配 [1]。有趣或重要的結(jié)構(gòu)很容易被遺漏或忽略，因?yàn)榱Ⅲw顯微鏡的“正常目標(biāo)”可能會(huì)出現(xiàn)球面像差，這些像素被優(yōu)化用于直接暴露在空氣中的樣品（無浸沒或嵌入介質(zhì)）。對(duì)于使用“z-堆疊”軟件功能創(chuàng)建的3D合成圖像，像差尤其明顯，因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)在z方向上看起來是細(xì)長(zhǎng)的。

對(duì)于復(fù)合顯微鏡也會(huì)出現(xiàn)相同的現(xiàn)象，但是存在液體浸漬化合物物鏡，其可以與鏡片和樣品之間的液體層一起使用。通常，浸沒液體是水或油，這些有助于顯著減少上述圖像像差。

用于立體顯微鏡的Leica Plan Apo 2x物鏡于2010年推出。由于有效數(shù)值孔徑為0.35，它實(shí)現(xiàn)了1,050線對(duì)/ mm（可見光為952 nm）的分辨率。與早期的顯微鏡系統(tǒng)相比，這種分辨率的提高部分歸功于FusionOptics  [2]。FusionOptics技術(shù)利用非對(duì)稱變焦鏡頭，為立體顯微鏡用戶提供觀察樣本（通過目鏡）的最佳3D感知，并具有最高分辨率和相應(yīng)的景深。不幸的是，當(dāng)使用Plan Apo 2x物鏡對(duì)浸入式或嵌入式介質(zhì)進(jìn)行成像時(shí)，可能會(huì)出現(xiàn)球面像差問題。

用作脊椎動(dòng)物胚胎發(fā)育模型系統(tǒng)的水生生物的研究，如斑馬魚，仍然需要更高的分辨率，更好的光傳輸和更好的信噪比（S / N）性能。對(duì)于具有立體顯微鏡的熒光應(yīng)用，這種需求尤其如此。當(dāng)使用針對(duì)暴露在空氣中的樣品進(jìn)行優(yōu)化的這種高分辨率物鏡時(shí)，在次優(yōu)條件下觀察并記錄明顯嵌入和浸沒的樣品以及帶有蓋玻片的樣品。

消除圖像像差

存在具有“校正環(huán)”的顯微鏡物鏡，其允許調(diào)節(jié)透鏡浸沒介質(zhì)與樣品浸沒或嵌入介質(zhì)之間的折射率的不匹配。校正環(huán)的調(diào)整導(dǎo)致物鏡內(nèi)的一組透鏡的位置發(fā)生偏移。目標(biāo)項(xiàng)圈如何校正折射率不匹配的說明如圖1所示。

物鏡的校正環(huán)使用戶能夠消除球面像差并獲得嵌入（聚合物或玻璃）或液體浸入（水）樣品/樣品的圖像，具有更清晰，更清晰的焦點(diǎn)。在校正與物鏡軸的折射率不匹配之后，似乎不存在浸沒或嵌入介質(zhì)。適當(dāng)調(diào)整物鏡校正環(huán)提高了空間分辨率和圖像的S / N比。

具有校正環(huán)的立體顯微鏡物鏡的示例是Leica Plan Apo 2x Corr物鏡。使用Leica Plan Apo 2x Corr，即使是厚的嵌入樣品或浸入深水溶液（5 mm）中的樣品也可以成像很少或沒有像差。

圖1：浸沒或嵌入的樣品/樣品的顯微鏡觀察; 通過光學(xué)系統(tǒng)追蹤光線（黃色）（藍(lán)色虛線是光軸）。
- 未校正的情況：樣品浸入/嵌入介質(zhì)與空氣之間的折射率不匹配導(dǎo)致球面像差和圖像沿垂直方向的伸長(zhǎng)  [1]。
- 校正情況：能夠調(diào)整折射率失配的物鏡可以在很大程度上消除像差。

應(yīng)用實(shí)例

許多用戶使用立體顯微鏡檢查或記錄嵌入式和液體浸沒的樣品/樣品。以下示例演示了使用具有Leica 2x Plan Apo Corr物鏡的立體顯微鏡時(shí)的圖像質(zhì)量改善（假設(shè)正確設(shè)置和調(diào)整）。

樣品/樣品浸入水溶液中

牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮（BPAE）細(xì)胞被用作心血管功能和疾病研究的模型系統(tǒng)  [3]。使用熒光FluoCells牛肺動(dòng)脈內(nèi)皮（BPAE）圖像細(xì)胞®，的MitoTracker ®紅，CMXRos，BODIPY ® FL phallacidin和DAPI（分子探針，萊頓，荷蘭）在圖2中看到他們用獲得的徠卡M205 FA立體顯微鏡，Leica 2x Plan Apo物鏡或Leica 2x Plan Apo Corr物鏡，Leica DFC3000G數(shù)碼相機(jī)和LAS X軟件。

在圖2A中，僅具有phallacidin通道的熒光圖像和用Leica 2x Plan Apo物鏡（無校正環(huán)）捕獲的明視場(chǎng)圖像。該BODIPY ®  FL phallacidin污漬選擇性的F-肌動(dòng)蛋白絲。獲取圖像Z-堆棧并顯示每個(gè)堆棧的最清晰圖像。沒有應(yīng)用圖像處理算法，因此這些圖像顯示原始數(shù)據(jù)。

在圖2B中，使用Leica 2x Plan Apo Corr物鏡捕獲圖像，其中校正環(huán)設(shè)定為0.25mm以補(bǔ)償包埋介質(zhì)和蓋玻片。通過在略微不同的設(shè)置下目視觀察和比較用校正環(huán)獲得的一系列Z-堆疊來識(shí)別校正環(huán)的最佳位置。圖像清楚地顯示了校正環(huán)上的正確設(shè)置對(duì)圖像質(zhì)量的差異。細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白絲結(jié)構(gòu)變得更加可見并且S / N比得到改善。與大多數(shù)類型相比，BPAE細(xì)胞樣本非常薄。

圖2：A：用蓋玻片嵌入載玻片上并用Leica M205 FA立體顯微鏡捕獲的BPAE細(xì)胞的熒光圖像，其中使用沒有校正環(huán)的2x Plan Apo物鏡。細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白絲（紅色箭頭）是可見的，但看起來模糊。在細(xì)胞邊界處還有輕微的模糊（白色箭頭）。B：使用具有校正環(huán)的Leica 2x Plan Apo Corr物鏡的相同樣品。肌動(dòng)蛋白絲（紅色箭頭）變得更加明顯。細(xì)胞邊界處的模糊（白色箭頭）顯著減少。核中的結(jié)構(gòu)可以更好地分辨。

較厚的樣本可以看到更大的效果，例如斑馬魚的幼蟲浸入深達(dá)數(shù)毫米的水溶液中  [4]。下面的視頻（圖3）是用Leica M165 FC立體顯微鏡，Leica 2x Plan Apo物鏡或Leica 2x Plan Apo Corr物鏡和Hamamatsu Orca-R2數(shù)碼相機(jī)獲得的。斑馬魚幼蟲在其血管中表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）。

圖3：表達(dá)綠色熒光蛋白（GFP）的斑馬魚幼蟲浸沒在水溶液中的熒光視頻成像。使用Leica M165 FC立體顯微鏡捕獲圖像，其中使用具有（右圖像）和不具有（左圖像）校正環(huán)的Leica 2x Plan Apo物鏡。在兩個(gè)視頻中看到斑馬魚幼蟲的心臟跳動(dòng)。幼蟲在右側(cè)的未校正圖像中顯得模糊。由M. J. Hamm和W. Herzog提供，血管生成實(shí)驗(yàn)室，Max Planck分子生物醫(yī)學(xué)研究所和德國(guó)明斯特的Westf?lischeWilhelms大學(xué)。

樣品嵌入聚合物中

市售的發(fā)光二極管傾向于嵌入聚合物中以供實(shí)際使用。嵌入聚合物中的LED的圖像顯示在圖4中。它們是用Leica M205 FA立體顯微鏡，Leica 2x Plan Apo物鏡或Leica 2x Plan Apo Corr物鏡，DFC450數(shù)碼相機(jī)和LAS X軟件獲得的。

在圖4A中，使用Leica 2x Plan Apo物鏡（無校正環(huán)）捕獲的明場(chǎng)圖像。可以看到LED的各個(gè)部分。獲取圖像Z-堆棧并顯示每個(gè)堆棧的最清晰圖像。沒有應(yīng)用圖像處理算法，因此這些圖像顯示原始數(shù)據(jù)。

在圖4B中，使用Leica 2x Plan Apo Corr物鏡捕獲圖像，其中校正環(huán)設(shè)置為2 mm以補(bǔ)償塑料。如前所述，通過在略微不同的設(shè)置下目視觀察和比較用校正環(huán)獲得的一系列Z-堆疊來識(shí)別校正環(huán)的最佳位置。可以看到圖像質(zhì)量的明顯差異。LED段聚焦清晰，S / N比提高。

圖4：A：嵌入聚合物中的LED的明場(chǎng)圖像，其使用Leica M205 FA立體顯微鏡捕獲，其中使用沒有校正環(huán)的Leica 2x Plan Apo物鏡。各個(gè)LED段可見，但看起來很模糊。B：使用具有校正環(huán)的Leica 2x Plan Apo Corr物鏡的相同樣品。LED部分現(xiàn)在更清晰，更清晰。模糊顯著減少。

概要

由于空氣與樣品或樣品的液體或嵌入介質(zhì)（例如聚合物）之間的折射率不匹配而導(dǎo)致的球面像差會(huì)降低顯微鏡觀察的質(zhì)量  [1]。觀察期間樣品的特定特征可能會(huì)變形。用于觀察浸入或嵌入樣品的光學(xué)顯微鏡（立體或復(fù)合）用戶可以通過使用校正折射率失配的物鏡來避免像差和圖像失真。