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尼康顯微鏡超分辨率顯微鏡的分子密度

必須以單分子超分辨率成像被認為是關(guān)鍵的方面是每個單獨的定位測量的精度，這已被定位于最終圖像（通常被稱為分子密度）探針的密度，和標簽本身的物理尺寸。分辨率和單個分子的定位精度之間的關(guān)系容易地確定。解決兩種熒光分子作為單獨的實體的能力是由定位精度，這就決定了每個分子的位置（和不確定性），從而所述一對之間的距離的限制。定位的精度，進而，主要取決于在一個單一的激活失周期從熒光分子收集光子的數(shù)目，所提供的背景噪聲可以忽略不計。這種互動式的教程探討分子密度和圖像分辨率的概念。

本教程初始化了尼康顯微鏡一組定位點在窗口稀疏，代表在一個虛擬的樣本低程度的分子密度。為了操作的教程，使用局部分子密度滑塊增加局部分子的數(shù)目，并因此出現(xiàn)在窗口中的圖像的分辨率。在最高的分子密度，很好的標本細節(jié)變得明顯。一種新的樣品可以使用下拉菜單來選擇。

分子密度和最終圖像的分辨率之間的關(guān)系是在奈奎斯特采樣定理，這要求每解析單元大約兩個數(shù)據(jù)點而言最好的說明。在將標記效率（在效果的指標分數(shù)被標記的）的試樣的情況下是不夠的，工件如不連續(xù)精細結(jié)構(gòu)細節(jié)可以出現(xiàn)在超分辨的圖像。必要局部熒光探針因此，對于具有尺寸α的空間特征的二維圖像時，所需的最小的分子密度，以滿足奈奎斯特準則是：

Nyquist Molecular Density ≈ (2/α)2(1)

因此，例如，為了實現(xiàn)20納米的分辨率在兩個維度，一是熒光團必須位于至少每10納米，并且需要為每平方微米約10,000個分子的一個非常高的分子密度。對于超高分辨率的三維空間，20納米的分辨率要求每立方微米約一百萬的熒光。在實踐中，低得多的分子密度常常是足夠的，當試樣的幾何形狀考慮在內(nèi)。生物結(jié)構(gòu)往往異構(gòu)使得即使具有相對高的豐度靶位點的飽和度標記可導(dǎo)致較低的總密度。在一般情況下，熒光探針的足夠的密度必須存在，才能充分映射的標記結(jié)構(gòu)的精細的細節(jié)。用相同的標準，這些熒光探針的足夠數(shù)量必須成功地在成像過程中的局部。

在單分子的超分辨技術(shù)通過采用光開關(guān)的熒光團（例如PALM和STORM）在時間上分離的熒光發(fā)射，的開和關(guān)的切換動力學(xué)的比率是一個重要的實驗參數(shù)應(yīng)該是微調(diào)的分子密度。在上面描述為每平方微米萬的熒光團的分子密度，以實現(xiàn)20納米的橫向平面上的最終分辨率的情況下，大約600個熒光團必須駐留在點擴散函數(shù)的橫向投影。這種高分子的密度可以通過一個事實，即大多數(shù)光開關(guān)熒光團都沒有在他們的暗狀態(tài)，從而導(dǎo)致高背景噪聲而變得復(fù)雜。這些熒光團或者發(fā)出微弱熒光，或者它們可以自發(fā)地切換到熒光狀態(tài)，在完全不存在激活的照明。非特異性的活化可以是自發(fā)的或工件可以由成像激光誘導(dǎo)。在情況下，分子的密度非常高，大量的非特異性激活的熒光團可以生成單分子圖像重疊，從而影響到實現(xiàn)高精度定位的能力。因此，建議采用了具有低暗態(tài)排放，低非特異性激活率光開關(guān)的熒光。

示于圖1是涉及影響在單分子超分辨率成像的空間分辨率的最關(guān)鍵因素之一，一個重要的概念。該決議與分子密度圖1表示為一系列黃色像素的測試圖案。可能存在于樣本的特征進行成像以逐漸降低的信號 - 噪聲比作為分子密度減小（從底部到圖1的頂部）（測量像素的分數(shù)），這些功能變得不可解析時的平均分子分離方法的特征尺寸（圖1中最上面一行）。因此，如公式（1）中，為了實現(xiàn)在尺寸n倍更高分辨率D，ND倍的像素必須被獲取的。為了不影響任一所述成像速度或信號 - 噪聲比，信號采集速率（每秒檢測到的光子）來實現(xiàn)這樣的分辨率增益必須由至少ND，這需要的因子增加ND倍高暴露于每個圖像的激發(fā)激光必需的。

中的時間分辨率來說，單分子基礎(chǔ)的超分辨率的方法不直接產(chǎn)生一個圖像，而是被用于映射個從數(shù)千的個攝像幀確定的特定分子的本地化。在這種情況下，時間分辨率是由所需要獲得合適的圖像成像的幀的數(shù)目來確定。此外，Palm和暴風影音成像用于光開關(guān)的熒光基團的性質(zhì)，可對時間的成像速度的限制。熒光蛋白是優(yōu)良的，用作在例基因編碼的探頭，其中定位于特定的亞細胞區(qū)室或生物分子的裝配是必需的。然而不幸的是，熒光蛋白顯示出相對緩慢的光控動力學(xué)相比，許多合成的探針，如Cy5標記和Alexa Fluor647，后者可以表現(xiàn)出高開關(guān)速度，使1毫秒的攝像周期在大約30納米，這是一個高分辨率的幅值大于那些熒光蛋白獲得的幾個數(shù)量級。開關(guān)周期的速度，以幫助確定單分子超分辨率顯微鏡的時間分辨率將是在適應(yīng)這種方法活細胞成像的終極限制。