什么是落射熒光顯微鏡
熒光團
熒光現象發生在特定波長的光（激發光）被物質吸收時，當物質從激發態返回到基態時，它釋放出能量時發出光。許多熒光物質（稱為熒光團）已被開發用于不同的用途，激發波長范圍從紫外到紅外。然而，發射波長通常比引起它們的激發能量的波長長。
落射熒光顯微鏡
是落射熒光顯微鏡指設計用于觀察上述熒光團的顯微鏡。光學系統包含用于激發的光源（通常為汞燈）和用于將激發光與熒光分離的濾光器塊。有許多過濾塊可用于不同類型的熒光基團，可隨時切換連續觀察多種熒光染料的標本。
激發塊在外熒光顯微鏡中的作用
如圖1所示，激發塊由兩種過濾器和一個分色鏡構成。選擇適當的過濾器和鏡子，使研究人員能夠獲得熒光和背景光之間的高信噪比（S / N）。以下描述這些光學元件的功能。
激發濾波器（EX）
激發濾波器是僅使從激發光源（通常為汞燈）激發所需的光的波長通過到熒光團的光學元件。如圖2所示，只有激發波長通過濾波器，通常是一個“帶通濾波器”。
分色鏡（DM）
二向色鏡是將激發光與熒光分開的光學元件。分色鏡是特殊的反射鏡，僅反射特定波長的光，允許所有其他波長通過（圖3）。落射熒光顯微鏡濾光片塊中使用的分色鏡以45°的入射角照射光，形成反射光的“阻帶”和透射光的“帶通”。通過激發濾光片的光線被90°反射到物鏡和樣品上。最后，從樣本發出的光線通過并指向觀察者（或高靈敏度相機）。
屏障濾波器（BA）或發射（EM）濾波器
屏障過濾器是將熒光發出的熒光與其他背景光分開的光學元件。如圖4所示，屏障濾光器透射通過分色鏡的熒光波長的光，同時阻擋從激發燈泄漏的所有其它光（從樣本或光學元件反射）。這是必要的，因為熒光燈的強度比激發光弱100,000倍以上。大多數屏障過濾器被放置在一個很小的角度，以通過抑制重影圖像來實現更好的熒光成像。
尼康的噪音終結者
尼康的落射熒光顯微鏡有專有的尼康光學元件，被稱為“噪音終結器”（型號TE2000及更高版本）。如圖1所示，噪聲終止器允許通過防止激發光在濾光片塊內散射并泄漏到觀察圖像中而有效地處理透過分色鏡的光。這有助于消除背景光噪音和更有效的熒光圖像。
選擇熒光過濾器和鏡子
選擇熒光濾光片和反射鏡時應遵循以下步驟。
熒光團（熒光物質）的波長
確定使用的熒光團的波長。這些信息在目錄中有記載，但熒光基團的波長特性也會根據溶液條件（如鹽度，pH值和細胞內條件）而稍有變化。因此，我們建議使用熒光計來測量激發和熒光波長。然后，使用這些信息來選擇最合適的光學元件。
分色鏡選擇
選擇的分色鏡必須有效地分離激發光和熒光的波長。具體而言，必須通過將反射鏡放置在45°入射角時將反射鏡的特性曲線與熒光團的波長進行比較來找到透射率截止在熒光團的激發波長與其熒光波長之間的二向色鏡。
如果熒光團的激發波長和熒光波長接近，斯托克（Stoke）位移（注1）較小，則應選擇截止波長較小的反射鏡，以盡可能多地使熒光信號通過。
屏障過濾器選擇
選擇一個允許樣品熒光波長通過的過濾器。通常，在帶通濾波器上選擇傳輸長波長的長通濾波器。然而，當從多重染色的樣本分離波長時，或者當使用對較長波長敏感的相機時，不傳輸這些較長波長的帶通濾波器通常用作屏障濾波器。
激發濾波器選擇
選擇一個允許激發波長平穩通過的濾波器。尤其是當使用汞燈作為光源時，通過將汞燈的線譜結合到波長中來實現有效的激發。允許除物鏡熒光團的激發波長之外的波長通過將增加背景光并破壞樣品。如圖7所示，對于440nm的波長，激發效率較低。
屏障濾波器和激發濾波器的組合
屏障濾光片和激發濾光片的理想組合是一種不讓光線通過的組合。發出的熒光非常弱，所以任何通過濾光片泄漏的光都會降低圖像質量。
獲得明亮的熒光圖像
有時建議去除激發光學中的ND濾光片，并增加激發光源的強度。然而，增加激發光源的強度會使熒光團快速漂白并損壞樣品，并增加電池中的自發熒光（注2）。由于這些原因，光源應該盡可能地弱，并且觀察光學器件盡可能高效地拾取熒光信號（通過擴大目標孔徑，增加熒光濾波器的波段，使用更靈敏的相機等）。
[注1]斯托克變換是指激發能量與熒光能量之間的能量差異，因能量在熱熒光材料中從激發態回落到其基態時的熱能部分損失而產生。（巖波書店理化辭典）
[注2]自發熒光是指熒光物質在除熒光物質以外的物質中的存在。例如，細胞成分如NAADPH或核黃素在未染色的細胞中在短波長范圍（紫外至可見光）中發出相對較強的熒光。
減少漂白
您可以采取以下步驟來減少漂白。
使用抗漂白劑
對苯二胺等防漂劑可用于FITC，羅丹明可用正丙基鎵。
使用ND濾鏡
在顯微鏡上使用中性密度或ND濾光片，將光線水平降低到觀察所需的最低水平。有時這可能需要將濾波器設置為100％，同時采取措施盡可能不分割光路。
使用抗漂白熒光團
使用可用于每個測試目的的最漂白的熒光團。
